突破纳米孔蛋白测序瓶颈，浙大团队实现单氨基酸直接分辨

蛋白质是重要的生物大分子，但由于缺乏普适、高效的测序技术，人们对它的了解还极其有限，这制约了人类对于生命世界的进一步理解。针对这一挑战，浙江大学化学系冯建东团队提出了基于固体纳米孔的氨基酸识别方法，他们所构建的直径为1纳米左右的人工纳米孔可进行单个氨基酸分子的精准识别，分辨率达到0.94道尔顿（Dalton，分子量的单位），显示出应用于单分子蛋白质测序的可能性。 

2023年5月20日，研究论文在《自然-通讯》（Nature Communications）发表。冯建东为论文的通讯作者，博士生王馥实是论文的第一作者。

自然界的各种“序列”蕴含着许多生命世界的奥秘。科学家常常需要通过测序来了解生物分子的一级结构。比如，组成基因的基本单位是碱基，“基因测序”测的就是不同碱基的排布顺序。而蛋白质测序是测量组成蛋白质氨基酸的排列顺序。

1951年，弗雷德里克·桑格完成了对胰岛素（一种由51个氨基酸组成的蛋白质）的测序工作，并因此获得诺贝尔化学奖。这是人类第一次测定蛋白质的氨基酸组成，从此认识到蛋白质具有特定的氨基酸序列。但是此后，桑格在“蛋白质测序”方面陷入了持续10年的瓶颈期。他转而尝试DNA测序和RNA测序，发明了双脱氧终止测序（又称“桑格测序法”），被广泛用于测定基因和基因组序列，这项发明改写了整个生命科学的研究进程和途径，也让桑格在1980年再度获得诺贝尔奖化学奖，它引领了人类三大科学计划之一的基因组计划和基因测序领域的整体飞速发展。

▲弗雷德里克·桑格（图片来源：诺贝尔奖官网）

然而，当前我们了解一种蛋白质的氨基酸序列的主流方法是利用质谱仪，但是在检测速度、读取长度和灵敏度方面还存在很大不足，其效力远不及基因组学和转录组学。“蛋白质测序‘起跑’比基因测序早，但没有像基因测序技术那样被广泛应用，”浙江大学生命科学研究院蒋超研究员说，“蛋白质是生命活动的主要承担者。但比起其基因，我们对蛋白质的了解要少得多，它们的结构是什么，有什么功能等，存在许许多多重要的问题需要回答，急需普适的、高效的测序手段。”当前，蛋白测序遇到的主要困境在于：蛋白结构复杂且构成单元氨基酸具有更强的异质性，蛋白也无类似核酸扩增的技术，低丰度蛋白分析困难。

▲组成蛋白质的20种天然氨基酸（图片来源：冯建东团队）

今年1月，《自然》杂志刊文展望2023年即将产生重大影响的7项技术突破，单分子蛋白测序（Single-molecule protein sequencing）位列第一。《自然》杂志同时列举了单分子荧光和纳米孔作为两种潜在的单分子蛋白测序技术。 

我们不妨将纳米孔测序理解为一个拆盲盒的过程。盲盒里有一条“项链”，我们知道这条项链由几颗珠子构成，要“猜”出不同颜色的珠子是如何排列，先后顺序如何。“盲盒”里如果放的如果是某个基因“项链”，基因测序测的就是对4种颜色的珠子（四个不同的碱基）的排列顺序；而对于蛋白质“项链”来说，组成蛋白质的有20种氨基酸，其排列组合可能性就将陡然飙升到天文数字。2021年报道的MspA纳米孔（目前最灵敏的生物纳米孔之一）的灵敏区域（盲盒）长度内同时读取8个氨基酸，需要解析20⁸种电流信号，而同样的孔实现核酸测序则仅需要解析4⁴电流信号。

生物纳米孔本身由肽链折叠而成，它的灵敏度受限于纳米孔本身的尺寸。冯建东2018年3月加入浙江大学化学系，建立了物理生物学与精准测量实验室，他认为，要解决蛋白测序的研究需求，必须从根本上突破传统纳米孔的灵敏区域的长度限制。

利用纳米孔进行蛋白测序要解决两大挑战：一是空间分辨：氨基酸的异质性极强，测量的灵敏度要精准地区分不同氨基酸的“身份”；二是时间分辨：蛋白结构的展开和过孔操控。2015年，冯建东在瑞士洛桑联邦理工学院攻读博士学位期间，首次在人工纳米孔领域实现了单核苷酸分辨。

“结构决定分辨。如果我们把单个的孔做到足够小，只容许孔内有一个氨基酸分子，那么它的信息就有可能被精确识别。”冯建东介绍，他们尝试人工创造一个具有单个氨基酸敏感性区域、几乎是目前世界上最小的人工纳米孔，这样纳米孔测量的“盲盒”就可以被压缩到1个氨基酸。“类似于不同体型的人过一扇窄门，有的人可以顺利通过，有的人则会被挡在门外。”2019年，冯建东将这个挑战交给了攻读博士的王馥实，“你的这项挑战要比我博士时更难。核苷酸有4个碱基，而蛋白质有20个氨基酸，异质性更强了。”

▲利用二硫化钼纳米孔在溶液中检测单个氨基酸分子的示意图（图片来源：参考资料[1]）

在一张三层原子厚度的二硫化钼（MoS₂）上，研究人员通过电压在薄膜上 “戳”出一个洞，其实是让它丢掉几个原子，开出一扇仅容许一个氨基酸通过的“门”。这扇“门”的直径在亚纳米到1.6纳米之间。在电压的作用下，氨基酸会依次通过这扇门。“不同的氨基酸的体积不同，且表面带一定的电荷，当它们通过纳米孔时，通过纳米孔的离子电流会受到微小的扰动。当不同的氨基酸经过这扇门时，受到的扰动程度就会不一样。”博士生王馥实介绍，这种扰动的变化在皮安级别（1皮安等于10^-12安），我们根据区分扰动程度来识别不同的氨基酸。“就像不同的小猴子跳出水帘洞，不同的体型的猴子会再‘水帘’上留下不同的形状。”

▲利用深度学习模型对纳米孔测量的电流信号进行训练与识别（图片来源：参考资料[1]）

在这项工作中，研究人员通过对纳米孔的极限结构的设计，推进当前纳米孔测量分辨率到0.94道尔顿，实现了单个氨基酸分子的直接分辨，可在同一纳米孔内区分16种不同类型的氨基酸。解决了纳米孔蛋白测序空间分辨率的核心难题。

▲在二硫化钼纳米孔中分辨不同天然氨基酸分子（图片来源：参考资料[1]）

冯建东认为，使用纳米孔来高精度识别单个氨基酸的策略，为纳米孔单分子蛋白质测序提供了物理解析的可行性基础。

自然界的蛋白质分子有着难以想象的复杂性，除了序列，不同的化学修饰的变化也会产生丰富的“变异”，而这些“变异”与人类疾病息息相关。在这项工作中，研究人员实现了用纳米孔来识别氨基酸的磷酸化。“目前，我们的方法可以用于分辨不同的单个氨基酸分子；将来，我们希望能够一次性识别更复杂组合的多肽链，以及复杂的化学修饰。”

撰文 | 周炜

来源 | 浙江大学学术委员会