《自然》：孙金鹏/李乾团队揭示嗅觉感知的分子机制 | 专家点评

学术经纬2023年05月26日约 17 分钟

▎药明康德内容团队编辑

嗅觉作为最古老的基本感觉之一，是动物与外界的化学物质世界交流与互动的重要基础。外界物质（例如玫瑰，苹果，桂花，丁香等）释放的气味分子通过空气进入鼻腔，而在鼻腔中有一类易被气味分子的激活的神经元——嗅觉感受神经元（olfactory sensory neurons, OSNs）。气味分子激活特定嗅觉神经元后会被转化为电信号，从而引起特定的电传导模式，然后通过嗅球传递到大脑，产生嗅觉。其中，位于嗅觉神经元中识别气味分子的膜受体即为嗅觉受体（Olfactory Receptor）。

嗅觉受体通过“组合编码”的方式来识别气味分子，即一个嗅觉受体能识别多种气味分子，且一种气味分子能激活多个嗅觉受体。大量的嗅觉受体结合“组合编码”的气味识别方式，使得动物能识别并辨别数以万亿计的气味分子。除了基本的嗅觉感知以外，嗅觉受体还与动物摄食、交配、育婴、躲避天敌等生存攸关的行为息息相关。

嗅觉受体可以分为三个家族，第I类是气味受体（Odorant Receptor，简称OR）家族；第II类是痕量胺相关受体（Trace Amine-Associated Receptor，简称TAAR）家族。OR和TAAR都属于A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族。第III类是非GPCR嗅觉受体，主要包括四次跨膜蛋白A（Membrane-Spanning 4-pass A，简称MS4A）家族等。

近些年来，研究者们发现这些嗅觉受体还存在异位表达的分布，并参与调控重要的生理和病理进程。

例如第I类嗅觉受体ORs的异位表达研究包括：山东大学于晓/孙金鹏团队发现胰岛β细胞中的孤儿嗅觉受体OLFR109可以识别变性胰岛素和胰岛素多肽InsB:9-23，抑制胰岛素分泌，触发“刹车机制”以实现对胰岛素质量的监控（Cell Metab. 2022; 34(2):240-255）；美国拉霍亚免疫学研究所Klaus Ley团队发现小鼠血管巨噬细胞上表达的OLFR2识别辛醛，诱导小鼠巨噬细胞分泌IL-1β，诱发动脉粥样硬化（Science. 2022; 375(6577):214-221）等。

对第II类痕量胺相关受体TAARs的研究显示，TAAR1的表达位置与其他TAARs不同，主要表达在小鼠和人的大脑以及内分泌系统中，而在嗅觉感受神经元中没有分布，对于改善认知，情绪和注意力具有重要的调控作用，并且对胰岛素分泌以及体重的维持具有调控作用；TAAR4异位表达在免疫B细胞和NK细胞上，在免疫调节中扮演重要角色；TAAR9除了嗅觉感受神经元外，主要分布在肌肉和肾脏中，对于肌肉的机能以及肾脏的功能具有潜在的调控作用。

因此，嗅觉受体也作为新的药物靶点而越来越受到青睐。从分子层面解析嗅觉受体如何识别不同配体并激活多样的Gα蛋白信号通路，对于理解嗅觉感知产生的机制及靶向嗅觉受体的新药研发具有重大意义。

2023年5月24日，山东大学/北京大学孙金鹏团队和上海交通大学医学院李乾团队合作在Nature上在线发表研究论文“Structural basis of amine odorant perception by a mammal olfactory receptor”，聚焦II类嗅觉受体TAAR家族识别配体的分子和结构机制。

TAAR受体家族在人类中有6名成员，在小鼠中有15名成员，其相对于其余嗅觉受体家族而言有如下特点：第一，TAAR受体数目相对较少，便于筛选结构稳定的受体；第二，TAAR特异识别胺类分子，便于筛选其配体；第三，TAAR与配体的结合呈现非常高的亲和力，例如小鼠TAAR9受体（mTAAR9，TAAR家族成员之一），能以EC₅₀（半最大效应浓度）在几纳摩到几十纳摩的级别结合含有一个、两个和多个氨基基团的单胺（苯乙胺PEA和N,N-二甲基环己胺DMCHA）、二胺（尸胺CAD）和多胺（亚精胺SPE）分子。

▲小鼠mTAAR9识别的配体及其化学结构式和EC₅₀（图片来源：孙金鹏课题组）

研究团队利用单颗粒冷冻电镜技术解析了上述4种内源性胺类配体作用下mTAAR9与Gαs及Gαolf蛋白三聚体复合物的结构，发现了嗅觉受体特异的结构及配体结合口袋，揭示了嗅觉受体“组合编码”识别配体的结构机制，阐明了II类嗅觉受体独特的激活方式，解析了mTAAR9与Gαs和Gαolf偶联的结构差异。该研究系统地揭示了嗅觉感知的分子机制，为靶向嗅觉受体的药物开发提供理论及结构基础。

▲不同配体结合的小鼠嗅觉受体mTAAR9与Gαs及Gαolf蛋白三聚体复合物的结构（图片来源：参考资料[1]）

本研究具体的新发现包括：

1、发现了mTAAR9独特的胞外“篝火”结构

研究者发现，与其余已知结构的生物胺GPCR受体（如β2-AR和D1R）相比，mTAAR9的结构呈现出一个非常独特的结构特征：如下图所示，N端的C22（C22^Nter）和第二个胞外段的C186（C186^ECL2）形成了一对C22^Nter:C186^ECL2二硫键，将mTAAR9的N端托起并固定在ECL2和ECL3上，类似“篝火”样。这对二硫键对于mTAAR9识别其配体，以及稳定受体激活态的胞外构象至关重要。值得注意的是，C22^Nter和C186^ECL2这两个氨基酸在TAAR家族中高度保守，提示这对二硫键对整个TAAR受体家族的配体识别都非常重要。

▲mTAAR9中特异且关键的C22^Nter:C186^ECL2二硫键（图片来源：参考资料[1]）

2、揭示了TAAR识别胺类气味分子的通用机制及嗅觉受体“组合编码”的结构基础

通过比较上述多个不同配体激活mTAAR9的结合模式，研究者发现了mTAAR9识别胺类气味分子的通用基序：D/E112^3.32-W271^6.48-Y301^7.43基序，其中带负电的D/E112^3.32与胺类分子中带正电的氨基形成盐桥，而Y301^7.43也能氨基形成极性相互作用，从而协助D/E112^3.32稳定整个氢键结合网络，W271^6.48则是作为受体的激活开关（toggle switch）角色发挥功能。D/E112^3.32-W271^6.48-Y301^7.43基序在TAAR家族中也是高度保守的。

▲mTAAR9识别多个配体的通用D/E^3.32-W^6.48-Y^7.43基序（图片来源：参考资料[1]）

“组合编码”的配体识别方式，大大拓展了嗅觉受体识别的气味分子数目，但“组合编码”的结构机制还不清楚，TAAR及其配体识别提供了一个非常好的模型，可以对这个问题进行探究。哺乳动物的TAAR5和TAAR9都能识别亚精胺SPE，而TAAR4、TAAR6、TAAR7d和TAAR9都可以识别苯乙胺PEA，研究者根据序列比对和结构分析发现，除了上述结合所有配体都需要的D/E^3.32-W^6.48-Y^7.43基序外，T^3.29-T^3.33和F^3.37-F^4.61-Y^6.51-V^7.39基序是识别SPE所特异的，F/Y^3.37-Y^6.51-Y^7.35-V^7.39基序则是识别PEA所特异的。

3、阐明了mTAAR9受体激活分子机制

那么mTAAR9受体结合了配体后是如何被激活的呢？研究者将解析的配体结合的mTAAR9激活态结构与AlphaFold2预测的mTAAR9非激活态结构进行比较，发现W271^6.48是关键的激活开关，配体结合W271^6.48后会将W271^6.48往下推1-2 Å，进而改变第六个跨膜区段（TM6）的构象，使TM6与TM3间距增加，从而改变了整个受体的构象，使得mTAAR9激活。这一激活机制与经典的生物胺GPCR受体（如β2-AR和D1R）激活机制很相似，但是研究者还发现了二者之间的差异。如下图所示，TM3和TM6之间的距离在激活的mTAAR9中比激活的β2-AR更大，这是由于β2-AR中的I278^6.40被TAAR家族中保守且特异的A263^6.40替代，而这一替代可能影响了与R130^3.50的结合。

▲mTAAR9的激活机制及与β2-AR激活机制的比较（图片来源：参考资料[1]）

4、解析了mTAAR9和Gαolf的偶联机制

如前所述，嗅觉受体可以偶联Gαs，也可偶联嗅觉特异的Gαolf蛋白，但Gαolf蛋白的结构从未被解析过。嗅觉受体如何结合Gαolf蛋白还没有阐明，嗅觉受体偶联Gαs与Gαolf的结构差异也不清楚。在本研究中，研究者比较了mTAAR9偶联Gαolf与偶联Gαs的构象差异，发现相较于Gαs，Gαolf的整体构象更为松散，相应地，mTAAR9的第2个胞内段（ICL2）以及TM3、TM5和TM6的近胞内段也发生了构象改变，以更好地结合Gαolf。

▲mTAAR9偶联Gαolf的结构机制（图片来源：参考资料[1]）

综上，该研究为探索嗅觉受体识别配体的结构和分子机制开创了新途径，也促进未来靶向嗅觉受体的药物候选分子研发。

山东大学郭璐璐研究员、朱孔凯副研究员，山东大学特别资助类博士后程杰、陆燕，硕士研究生连硕、柳群，北京大学博士研究生郑媛为本文的共同第一作者；孙金鹏教授、李乾研究员、杨帆教授和徐云飞教授为本论文共同通讯作者。连硕是由山东大学孙金鹏教授和齐鲁医院徐云飞教授联合培养。

孙金鹏教授课题组近年来对GPCR在感觉中的作用进行了系列的研究，先后阐明了痒觉感知的结构基础（Nature 2021）和GPCR对力感知的分子机制（Nature 2022a, Nature 2022b）。李乾研究员课题组在嗅觉受体的研究中有多年的积累，解析了特异嗅觉受体基因表达及进化机制（Nature Communications 2021, Molecular Biology and Evolution 2022）、嗅觉受体蛋白信号调控通路（PNAS 2022）和嗅觉受体相关功能神经环路基础（eLife 2021, Cell Reports 2020）。

专家点评

张旭博士（中国科学院院士、中国医学科学院学部委员、发展中国家科学院院士，聚焦躯体感觉的分子细胞和神经网络机理研究）

当我们漫步在春日的郊野中，温暖的阳光下春风拂面，满目翠绿、鸟语花香，我们整个身心都会感到轻松和愉悦。就像这样的画面里，我们在生活中每时每刻都在接受环境中多样的信息，感觉系统就是我们与外界环境互动的基础。在长期的演化过程中，我们拥有了一些基本的感觉：视觉、听觉、嗅觉、味觉和躯体感觉（包括触觉、温度觉、痛觉、痒觉等），来感知对生存和生活最重要的环境信息（光、声、气味、食物、温度、痛、痒等），帮助我们做出正确的行为反应。

感受器细胞是感觉系统识别环境信息的第一道门户，感受器细胞的膜蛋白则负责感知最适宜的外界刺激，并将信号传递到细胞内，激活感受器细胞，完成感觉传递的第一步换能过程，即将环境信息转变为特定感受器细胞的激活。对这一步换能过程的机制研究获得了多次诺贝尔奖的肯定，听觉信息在耳蜗处理的生理机制、视觉信息在视网膜处理的生理和分子机制、嗅觉信息处理的分子机制以及温度和触觉信息处理的分子机制分别获得1961年、1967年、2004年以及2021年诺贝尔生理或医学奖。其中温度觉、触觉、听觉和味觉中酸/咸的感知是通过细胞膜上的离子通道完成的，而视觉、嗅觉和味觉中苦/甜/鲜的感知则依赖于一类特殊的细胞膜受体：七次跨膜的G蛋白偶联受体（GPCR）。

自从感受器细胞中的关键膜蛋白被鉴定出来后，科学家们对这些膜蛋白如何感知外界信息进而激活感受器细胞的机制产生了浓厚的兴趣。得益于结构生物学的飞速发展，视觉、听觉、温度觉、触觉和味觉受体感知配体的结构机制被逐步解析出来，然而对于嗅觉信息感知的结构基础知之甚少。嗅觉系统需要处理环境中多样的挥发性气味分子，信息量巨大，因此处理嗅觉信息的膜蛋白（称为嗅觉受体）数目非常多。实际上，嗅觉感知的GPCR受体基因家族也是迄今最大的，小鼠中有超过1000种有功能的嗅觉受体，人类中有近400种有功能的嗅觉受体。这些嗅觉受体中结构稳定的数目有限，大多数嗅觉受体依然是孤儿受体，其配体还是未知的，这些因素都增加了嗅觉受体结构解析的难度。

最近，山东大学/北京大学的孙金鹏团队与上海交通大学医学院的李乾团队合作，聚焦一类特异的嗅觉受体亚家族，称为痕量胺相关受体（TAAR, Trace Amine-Associated Receptor），隶属于A类GPCR。研究团队应用冷冻电镜技术解析了TAAR家族成员之一的小鼠TAAR9（mTAAR9）在4种不同配体结合条件下与Gs和Golf（嗅觉特异的Gα）蛋白三聚体复合物的结构，进一步结合药理学分析揭示了mTAAR9感知配体后被激活的分子机制。TAAR受体家族成员数目相对较少，小鼠中有15个成员，人类中有6个成员，且配体大多为含有氨基基团的胺类分子，因此是研究嗅觉受体结构基础的较好模型。该团队首先通过筛选发现了TAAR家族中的mTAAR9可以与4种配体（苯乙胺、N,N-二甲基环己胺、尸胺和亚精胺）形成稳定的结构，mTAAR9具有独特的胞外二硫键，这一结构基础对mTAAR9乃至整个TAAR受体家族的配体识别至关重要。进一步的研究还发现mTAAR9采用了通用motif配合特异motif的方式识别不同配体，这为嗅觉领域“组合编码”的配体识别原则（即一个嗅觉受体识别多个气味分子，一个气味分子也能激活多个嗅觉受体）提供了关键的结构基础。最后，该团队还阐明了mTAAR9特异的激活机制以及Golf（Golf结构一直未知）偶联的分子机制。

综上所述，该研究阐释了一类特异嗅觉受体感知气味的分子机制，为嗅觉受体家族识别配体奠定了重要的理论基础，对开发靶向嗅觉受体的新药也有参考价值。此外，嗅觉受体不仅仅表达在嗅觉系统中，还在许多非嗅觉系统甚至非神经组织中表达，从而调控许多重要的生理过程，包括细胞分化、代谢、消化、癌症发生等，因此该研究也有助于对嗅觉受体在其它系统的功能探索。

赵素文博士【上海科技大学生命科学与技术学院、iHuman研究所，研究员，副教授（TENURED），聚焦蛋白质序列-结构-功能关系研究】

孙金鹏教授是GPCR药理学专家，博士后（2007-2011）师从GPCR药理学奠基人、2012年诺奖得主Robert Lefkowitz。他回国以后，在实验室逐渐建立起了完善的GPCR药理学平台，配体高通量筛选平台，和冷冻电镜结构解析平台，三个平台形成闭环。使用这些强大的平台，孙教授为多个GPCR发现了内源性配体，提出了多个重要的模型，发表了多篇重磅文章。李乾研究员是嗅觉专家，嗅觉受体（尤其是TAAR）一直是他的一个重要研究方向，多年来致力于TAAR的功能研究和脱孤。他的博士后导师Stephen Liberles，是TAAR领域的奠基人之一。而Liberles的博士后导师，则是因发现嗅觉受体基因家族和嗅觉系统的工作原理而获得诺奖的Linda Buck。

嗅觉是一种古老的化学感觉，对动物的生存、繁衍和社交极具意义。嗅觉产生的第一步，是表达在嗅觉神经元树突纤毛上的嗅觉受体对气味分子的识别。人类的功能性嗅觉受体，包括约400个气味受体（OR），和6个痕量胺相关受体（TAAR，因配体多是体内浓度较低的胺即痕量胺而得名）。OR和TAAR都是GPCR，都具有GPCR典型的七次跨膜结构，它们的数目合起来占了人类826个GPCR的一半，但它们的功能人类却知之甚少。近年来，多项研究表明，嗅觉受体除了在嗅觉神经元表达外，在非嗅觉组织也存在着广泛的表达并调控着重要的生理功能。这些发现使得它们一跃而为潜在药物靶点，身价倍增。

嗅觉受体通过“组合编码”的方式来识别气味分子，即一个嗅觉受体能识别多种气味分子，且一种气味分子能激活多个嗅觉受体，识别和激活的强弱各不相同。但这种“组合编码”的机制，一直缺乏结构基础。业内公认，嗅觉受体难表达，难纯化，配体少，配体弱，结构不稳定，药理学上缺乏好的检测手段，研究难度非常大。数目上占了GPCR半壁江山的嗅觉受体，在2023年之前竟然没有一个实验结构！与之相对的是，在过去的十几年中，GPCR的结构生物学取得了突破性进展，约170个受体的1000多个结构获得了解析，其中绝大部分都是GPCR-配体复合物结构。嗅觉受体的结构解析工作，让多个实验室折戟沉沙。

针对嗅觉受体中研究中的这些难题，两个课题组精心选择了TAAR作为突破口，强强联手。TAAR是一类非经典的嗅觉受体，相较于气味受体，TAAR有以下优点：1）容易筛选出结构稳定的受体，因为TAAR数量比OR少很多；2）容易筛选出正确的配体，因为配体是特征明确的胺类分子；3）配体亲和力很高，好的可以达到几nM的水平；4）TAAR和非嗅觉GPCR中的经典胺类受体（配体是神经系统中浓度较高的生物胺，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、五羟色胺和组胺），还存在着不少相似之处，在研究中可以借鉴：例如，它们都有识别胺类配体的D/E^3.32，都有配体结合的总感受器，即常被成为“拨动开关”（toggle switch）的W^6.48，都有对GPCR激活重要的P^5.50和P^6.50，而这些位点在气味受体OR中则不保守。

在这篇文章中，两个课题组一举解析了小鼠TAAR9（mTAAR9）的五个结构：亚精胺-mTAAR9-Gs，苯乙胺-mTAAR9-Gs，N,N-二甲基环己胺-mTAAR9-Gs，尸胺-mTAAR9-Gs和苯乙胺-mTAAR9-Golf。这些结构系统揭示了mTAAR9如何识别多种类型的配体，如何激活，如何偶联Gs和Golf，以及这些机制如何外推到其它嗅觉受体。

本研究发现，识别胺的基序是D/E^3.32-W^6.48-Y^7.43和胞外区的一对二硫键C22^Nter:C186^ECL2，这五个残基在TAAR家族中高度保守。特异性识别亚精胺的基序，是T^3.29-T^3.33和F^3.37-F^4.61-Y^6.51-V^7.39，在哺乳动物的TAAR5和TAAR9中存在；其中T^3.29-T^3.33识别亚精胺中的N10，如果把mTAAR6、mTAAR7d和mTAAR8c在这两个位点上不是Thr的残基都突变成Thr，则这三个受体也可以识别亚精胺。特异性识别苯乙胺的基序，是F/Y^3.37-Y^6.51-Y^7.35-V^7.39，在哺乳动物的TAAR4、TAAR6、TAAR7d和TAAR9都存在。当然，虽然都可以被识别，同一个配体（如苯乙胺）针对不同受体的活性通常是有区别的。因此，本研究找到了一个非常好的模型，为嗅觉受体以“组合编码”的方式识别气味分子提供了鲜活的结构基础和药理证据，充分展示了目标蛋白选取的艺术。

在A家族GPCR的共同激活通路中，有三个残基3.43，6.40和6.41，在非激活态中形成疏水锁，是受体激活时需要克服的一个能垒。在TAAR中，6.40是Ala；在大多数胺类受体中，6.40是一个较大的疏水残基，如β2AR的6.40是Ile。本研究发现，很可能是由于TAAR的6.40位点的Ala比较小，使得疏水锁较弱，和激活态的β2AR相比，mTAAR9激活态中，TM3和TM6这两条螺旋分开的角度更大。另一个非常有意思的发现是，在mTAAR9/mTAAR5中，把A^6.40突变成I/L后，受体激活Golf通路的能力大受影响，而激活Gs通路的能力不变。这样，作者就揭示了，选择使用A^6.40，而非I/L^6.40，是TAAR类受体可以选择性使用Golf通路的关键。

嗅觉受体可以偶联Gs，也可偶联嗅觉特异的G蛋白Golf，这两种蛋白的序列同一性超过80%。虽然第一个气味受体和Gs的复合物结构发表于两个月前，但从投稿时间看，这篇文章早了40天。发表时间的先后，可能是因为文章中所放的结构数目不同，引起评审问题的多少所导致。最先发表的嗅觉受体结构只有与Gs的复合物，缺乏与Golf的复合物结构。本研究则填补了这项空白，既阐明了嗅觉受体结合Golf的细节，又通过比较mTAAR9-Gs和mTAAR9-Golf的结构，揭示了嗅觉受体在偶联这两种激活型G蛋白时的重要差异。通过结构分析，突变mTAAR9上多个G蛋白结合位点，并检测这些突变体激活Gs和Golf通路的能力，作者得出如下结论：相较于Gs，整体上Golf内部的堆积更松散，C端α5螺旋周围的几条环位置更靠下，和α5螺旋分得更开，因此需要受体的ICL2和TM3、TM5、TM6的胞内端发生相应的构象变化，努力往下伸，来更好地结合Golf。这部分研究，揭示了同类型G蛋白通路之间的精细选择性是如何被调控的，丰富了我们对GPCR下游通路选择性的理解。

综上，本研究两个课题组在嗅觉受体的结构、配体识别、药理和激活机制领域的一篇奠基之作。祝愿这两个课题组在嗅觉受体领域佳作不断，引领和推动嗅觉受体研究的大发展。

参考资料：

[1] Guo, L., Cheng, J., Lian, S. et al. Structural basis of amine odorant perception by a mammal olfactory receptor. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4