骨肉瘤(OS)是一种侵袭性恶性肿瘤，主要影响儿童和青年，是预后较差的转移性和复发性肿瘤。联合化疗的引入虽极大程度上改善了患者存活率，但也到达了生存改善的平台期，后续改善难度较大。由于OS的异质性和潜在靶向蛋白的脱靶情况，OS的免疫治疗难度较大，更多创新的免疫疗法亟待研发。近日，Mensali 团队在 Nature Communications 发表了题为 ALPL-1 is a target for chimeric antigen receptor therapy in osteosarcoma 的研究。该研究验证了ALPL-1在OS中的特异性表达，且可被TP-1和TP-3抗体识别。据此构建了两种嵌合抗原受体（CAR）分子OSCAR-1和OSCAR-3，通过一系列实验证实了OSCAR-T细胞对OS的有效性，提示OSCAR-T细胞或可成为部分OS患者的细胞疗法方案。
TP-1和TP-3单克隆抗体是从接种了来自原发性肺转移OS患者人源细胞系的小鼠体内分离所得，它们对OS有选择性，对其他肉瘤的反应性较低。研究通过过表达和基因敲除实验证实了TP-1和TP-3对ALPL-1的特异性。TP-1和TP-3均对ALPL-1 cDNA转染的HEK-293细胞有反应，但对亲代细胞无反应（图1）。同时研究通过在OHS细胞（可被TP抗体染色的OS细胞系）中使用CRISPR/ CAS9技术敲除ALPL基因进一步证实该发现（图2）。
图1. TP-1和TP-3流式直方图：野生型HEK-293细胞；ALPL-1转染的HEK-293细胞（HEK-293ALPL-1）；OHS细胞
图2. ALPL-1，TP-1和TP-3流式直方图：ALPL基因敲除OHS细胞（OHSALPL KO）和OHS亲代细胞研究人员又通过二代测序确定了ALPL-1在OS中的高表达，且通过对比在正常组织（骨，肺）及OS肺转移组织的ALPL-1表达量（图3），验证了运用TP抗体对膜蛋白ALPL-1的初步观察结果。
图3. ALPL-1在原发性(n = 9)和转移性(n = 5) OS以及正常骨(n = 24)和肺组织中表达(n = 14)基于上述发现，研究构建了TP-1和TP-3的CAR，命名为OSCAR-1和OSCAR-3，通过生物荧光杀伤分析验证了ALPL-1的存在对OSCAR-T细胞杀伤活性的重要性（图4）。同时也通过构建异种移植小鼠模型证实了OSCAR-T细胞对控制肿瘤生长的作用（图5，6）。
图4. 用生物荧光法(BLI)测定OSCAR-1和OSCAR-3对ALPL-1阳性细胞的细胞毒性
图5. 通过BLI获得的通量值来量化每只小鼠的肿瘤进展
图6. 异种移植小鼠的Kaplan-Meier生存分析最后，在验证了OSCARs对OS异种移植小鼠的有效性后，研究还对其进行了安全性评估。之前的免疫组化染色已经证实了ALPL-1的表达仅限于OS样本，而在健康组织中几乎检测不到（图7）。研究分离出可分化为成骨细胞的间质干细胞（MSCs），并测试OSCAR-T细胞的反应性（图8）。
图7. 用TP-3抗体对骨肉瘤和正常组织进行ALPL-1免疫组化染色结果
图8 ab. OSCAR-T细胞的细胞毒活性是通过与不同正常组织共培养的CD8(上)和CD4(下)T细胞上TNFα的产生和表达来测定的总之，该研究在体外环境和原发性/转移性骨肉瘤原位模型中证实了CAR-T细胞对ALPL阳性细胞的细胞毒性，且对造血干细胞或健康组织没有超出预期的毒性，进一步的安全性评估还需在后续的临床研究中进行。靶向ALPL-1的CAR-T细胞在临床前模型中显示出治疗OS的效率和特异性，为将来进行OS细胞疗法的临床转化提供了依据。撰文
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华莹奇/蔡郑东团队以多组学分析揭示骨肉瘤分子分型及靶向治疗探索
*本文由深圳市拾玉儿童公益基金会“儿童肿瘤前沿”团队编译或约稿，文中图表均源引自文献原文。本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。如需转载，请留言或联系[email protected]。本文旨在分享儿童肿瘤科研前沿成果，不是治疗方案推荐。如需获得疾病治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
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Osteosarcoma (OS) remains a dismal malignancy in children and young adults, with poor outcome for metastatic and recurrent disease. Immunotherapies in OS are not as promising as in some other cancer types due to intra-tumor heterogeneity and considerable off-target expression of the potentially targetable proteins. Here we show that chimeric antigen receptor (CAR) T cells could successfully target an isoform of alkaline phosphatase, ALPL-1, which is highly and specifically expressed in primary and metastatic OS. The target recognition element of the second-generation CAR construct is based on two antibodies, previously shown to react against OS. T cells transduced with these CAR constructs mediate efficient and effective cytotoxicity against ALPL-positive cells in in vitro settings and in state-of-the-art in vivo orthotopic models of primary and metastatic OS, without unexpected toxicities against hematopoietic stem cells or healthy tissues. In summary, CAR-T cells targeting ALPL-1 show efficiency and specificity in treating OS in preclinical models, paving the path for clinical translation.
DOI: 10.1038/s41467-023-39097-x
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