▎药明康德内容团队编辑帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见的神经系统退行性疾病，在全球大于65岁的老年人群体中患病率高达1-2%。2004年，科学家首次发现富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2）的突变体与帕金森病高度关联，自此该激酶成为帕金森病领域的研究热点之一。LRRK2基因的功能获得性突变是导致家族性帕金森病的最常见遗传因素，也是偶发性帕金森病的关键遗传风险因子。目前，已有研究鉴定到超过250个LRRK2基因突变，生化研究表明一些致病突变体的激酶活性呈明显增强（如最常见的致病突变体LRRK2G2019S）。因此，LRRK2成为治疗该疾病的潜在药物靶点，科学家也一直致力于找到针对它的抑制剂。值得一提的是，LRRK2特异性I型抑制剂DNL201和DNL151目前已在临床实验中取得较好的进展 。LRRK2蛋白在大脑、心脏、肾脏和肺等器官组织中广泛表达。其在体内参与多种细胞生理过程，包括自噬、神经突增生调控、突触形态发生、膜运输、蛋白质的合成以及一些线粒体疾病 。LRRK2蛋白全长包含有2527个氨基酸残基，由7个结构域所构成，同时具有激酶和GTP水解酶活性，其内部结构域之间的组装和相互调节均较为复杂。研究表明LRRK2蛋白在细胞内以多种聚集形式存在，包括单体、二聚体以及寡聚体，不同聚集状态的活性也有所差别。某些LRRK2致病突变体可以在微管（microtubule）表面形成纤维丝结构，从而影响微管相关的生理过程。LRRK2能被胞内过表达的Rab29招募到反式高尔基体网络附近并激活，从而增强其自磷酸化和磷酸化Rab底物的活性，调节下游生理功能 。然而，目前LRRK2激活的分子机制以及抑制剂的结合对LRRK2蛋白构象的调节均不清楚。2023年12月22日，美国圣裘德儿童研究医院孙吉课题组和英国邓迪大学生命科学学院Dario R. Alessi课题组合作在Science杂志发布的研究论文，首次报道了人源LRRK2与Rab29蛋白复合物的不同聚集状态（单体、二聚体及四聚体）以及LRRK2蛋白结合抑制剂DNL201的冷冻电镜结构，揭示了LRRK2被Rab29招募并激活的分子机制。在前期工作中，孙吉团队率先报道了人源全长LRRK2的系列高分辨率冷冻电镜结构，解析的所有LRRK2结构均处于开放失活构象（open inactive conformation），且目前激活态LRRK2结构仅局限于低分辨率的微管结合或I型抑制剂结合的LRRK2结构。为了捕获高分辨率激活态LRRK2三维结构，作者首先在体外重组Rab29-LRRK2复合物并成功解析其高分辨率结构，包含有三种聚集状态（单体、二聚体及四聚体）。结构显示，Rab29•GTP结合在LRRK2蛋白的N端ARM结构域。基于结构、生化酶活及激光共聚焦成像分析，研究揭示了介导Rab29招募与激活LRRK2的相互作用界面及关键氨基酸残基。在单体和二聚体构象中，LRRK2呈现出开放失活状态。出乎意料的是，作者在Rab29-LRRK2复合物的四聚体构象中不仅观察到处于开放失活状态的外围LRRK2分子（LRRK2peri），同时发现呈现闭合状态的中间LRRK2分子（LRRK2cent）。LRRK2cent呈现出激活态激酶的系列典型特征，包括“DYG-in”、稳定的active loop、向内靠拢的aC螺旋及空间连续的R-spine等。此外， LRRK2cent可以较完美地契合已报道的LRRK2结合微管的cryo-ET电子密度图。据此，文章推断四聚体中的LRRK2cent处于闭合激活态（closed active conformation）。由于LRRK2激活过程中的构象变化，导致LRRK2cent KIN结构域的一些关键二级结构原件与COR结构域发生直接相互作用 ，从而进一步地稳定该构象。突变体分析表明该相互作用对于维持LRRK2激酶活性至关重要。▲LRRK2激活过程中的构象变化（图片来源：研究团队提供）研究进一步提出，Rab29介导LRRK2的膜定位和不对称激活的潜在分子机制模型：1) 膜定位的Rab29•GTP招募LRRK2首先形成呈失活状态的单体和二聚体，伴随局部LRRK2分子浓度的提高而形成包含有激活态的四聚体。2) 在LRRK2激活过程中（四聚体形成），LRRK2cent发生较大的构象变化，其C端的KIN-WD40结构域靠近COR结构域并发生直接相互作用，从而形成稳定的闭合激活构象。3) 呈自抑制状态的LRRK2cent N端结构域（ARM-ANK-LRR）在激活过程中被释放，由于其柔性构象而无法被观测到。4) LRRK2cent N端结构域的释放导致KIN结构域被暴露，从而可以有效地对膜定位的Rab底物发挥激酶活性。另外，激活态LRRK2cent为一些致病突变体的工作机理进行了较好地结构阐释。▲Rab29招募并激活LRRK2的潜在分子机制模型（图片来源：研究团队提供）LRRK2特异性I型抑制剂的结合可以诱导LRRK2形成闭合类似激活构象（closed active-like conformation）。为了进一步地验证LRRK2cent确实处于闭合激活态以及研究LRRK2的药理学，作者解析了LRRK2结合I型抑制剂DNL201的冷冻电镜结构。结构比较发现，LRRK2结合DNL201的构象与LRRK2cent的构象整体相似，从而再次印证了LRRK2cent的活性构象推断。最后，作者比较分析了Rab29及其同源蛋白Rab32和Rab38对LRRK2的激活方式。尽管三者都可以膜定位并激活LRRK2对Rab10的磷酸化活性，但是只有Rab29的结合能够促进LRRK2四聚体形成并增强LRRK2 Ser1292位点的自磷酸化水平。LRRK2 Ser1292自磷酸化水平在LRRK2突变体携带者的尿外泌体呈现明显提高，暗示了Rab29介导的LRRK2四聚体形成与其Ser1292自磷酸化潜在的病理关联性。孙吉研究员介绍介绍道：“LRRK2的激活机制为了解LRRK2在体内功能提供了结构基础，同时也为针对LRRK2帕金森治疗药物的研发提供了新的思路。这项工作为药物优化、非活性位点抑制剂筛选以及多肽药物设计等提供了理论基础。”美国圣裘德儿童研究医院孙吉研究员为该文章的通讯作者。美国圣裘德儿童研究医院博士后朱涵文和英国邓迪大学生命科学学院Dario Alessi 研究组的Francesca Tonelli博士为本文共同第一作者。此外，美国圣裘德儿童研究医院冷冻电镜中心的工作人员Martin Turk博士和英国邓迪大学生命科学学院Alan Prescott博士也为该工作做出重要贡献。Zhu et al., Rab29-dependent asymmetrical activation of leucine-rich repeat kinase 2, Science (2023). DOI: 10.1126/science.adi9926[1]Zimprich, A., et al., Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron, 2004. 44(4): p. 601-7.[2]Paisan-Ruiz, C., et al., Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron, 2004. 44(4): p. 595-600.[3]Jaleel, M., et al., LRRK2 phosphorylates moesin at threonine-558: characterization of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem J, 2007. 405(2): p. 307-17.[4]Tolosa, E., et al., LRRK2 in Parkinson disease: challenges of clinical trials. Nat Rev Neurol, 2020. 16(2): p. 97-107.[5]Jennings, D., et al., LRRK2 Inhibition by BIIB122 in Healthy Participants and Patients with Parkinson's Disease. Mov Disord, 2023. 38(3): p. 386-398.[6]Jennings, D., et al., Preclinical and clinical evaluation of the LRRK2 inhibitor DNL201 for Parkinson's disease. Sci Transl Med, 2022. 14(648): p. eabj2658.[7]Kalia, L.V. and A.E. Lang, Parkinson's disease. Lancet, 2015. 386(9996): p. 896-912.[8]Purlyte, E., et al., Rab29 activation of the Parkinson's disease-associated LRRK2 kinase. EMBO J, 2018. 37(1): p. 1-18.[9]Myasnikov, A., et al., Structural analysis of the full-length human LRRK2. Cell, 2021. 184(13): p. 3519-3527 e10.本文来自药明康德内容微信团队，欢迎转发到朋友圈，谢绝转载到其他平台。如有开设白名单需求，请在“学术经纬”公众号主页回复“转载”获取转载须知。其他合作需求，请联系[email protected]。
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