神经母细胞瘤是儿童期颅外实体瘤中最常见的一种，约占儿童癌症相关死亡的12%-15%。复发/难治性神经母细胞瘤患者的预后较差，目前仍然缺乏令人满意的治疗方案。研究发现ALK受体在有些神经母细胞瘤中特异性表达，是神经母细胞瘤的致癌驱动因子，因此ALK成为治疗神经母细胞瘤的潜在靶点。近日，Roberto Chiarle 教授团队于 Cancer Cell 上发表题为 ALK inhibitors increase ALK expression and sensitize neuroblastoma cells to ALK.CAR-T cells 的重磅研究。作者团队开发了一款新型ALK.CAR-T 细胞，并在临床前模型中证明了ALK.CAR-T单药或联合ALK抑制剂治疗神经母细胞瘤的疗效及安全性。结果显示，对于ALK高表达的神经母细胞瘤，ALK.CAR-T单药治疗安全有效，但对于ALK低表达的神经母细胞瘤，单用活性不佳。幸运的是，研究同时发现，通过联合ALK抑制剂可上调ALK表达水平，特异性提升ALK.CAR-T肿瘤杀伤效果。这项研究证明，ALK.CAR-T单用或联合ALK抑制剂治疗神经母细胞瘤安全有效。
ALK.CAR-T细胞有效靶向ALK高表达的神经母细胞瘤为了评估CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性，作者首先在一系列神经母细胞瘤细胞系中对比不同CAR-T细胞的活性，包括：非转导T细胞（UT，阴性对照）、CD19.CAR-Ts（阴性对照），GD2.CAR-Ts（阳性对照）和ALK.CAR-Ts。结果显示，与非转导T细胞、CD19.CAR-Ts相比，ALK.CAR-Ts及GD2.CAR-Ts均可有效地清除大多数肿瘤细胞。具体而言，ALK.CAR-Ts可以有效清除ALK高表达的神经母细胞瘤细胞系（如NB-1），但是对于ALK低表达GD2高表达的细胞系（Kelly、SH-SY5Y），ALK.CAR-Ts的活性不及GD2.CAR-Ts（阳性对照）。 为了，评估ALK.CAR-T在体内的肿瘤杀伤活性，作者分别构建了ALK高表达和ALK低表达两种情况的神经母细胞瘤的转移模型。首先，作者探索了CAR-T细胞在ALK高表达神经母细胞瘤的转移小鼠（移植NB-1细胞系,ALK、GD2均高表达）中的活性。当肿瘤中位生物发光强度为1.2 × 10^7时，注射CAR-T细胞。结果显示，ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts均可快速且有效控制肿瘤生长，部分小鼠甚至保持无瘤生存120天以上（图1A）。而UT或CD19.CAR-Ts无法有效控制肿瘤。更重要的是，免疫组化结果显示扩散至肝、肾上腺、肾的肿瘤细胞也都被ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts有效清除（图1B）。图1.A：ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts均可快速且有效控制ALK及GD2高表达神经母细胞瘤的生长。B: 免疫组化结果显示扩散的肿瘤细胞被ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts有效清除。接着，作者探索了CAR-T细胞在ALK和GD2低表达两种的神经母细胞瘤（SK-N-SH和NGP）小鼠中的活性。在SK-N-SH肿瘤转移的小鼠中，ALK.CAR-Ts单用的抗肿瘤及延长生存期的作用十分有限，而GD2.CAR-Ts没有显示出显著活性（图2）。在NGP肿瘤转移小鼠中，ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts 单用均未能控制肿瘤生长。
图2.对于ALK和GD2低表达的神经母细胞瘤(SK-N-SH)，ALK.CAR-Ts抗肿瘤活性有限这些结果表明，ALK.CAR-Ts和GD2.CAR-Ts针对抗原高表达的神经母细胞瘤效果相当显著。但对于抗原低表达的神经母细胞瘤，活性有限。因此对于这类肿瘤仍需进一步探索其他治疗策略。ALK抑制剂与ALK.CAR-Ts联用，可进一步提升疗效ALK抑制剂，如ceritinib和lorlatinib，在小鼠模型以及携带ALK突变或扩增的神经母细胞瘤患者中展现抗肿瘤活性。既往研究表明，ALK受体激活后会被内吞并下调表达量，而ALK抑制剂可以上调ALK的表达。因此，作者推断，ALK抑制剂可提高神经母细胞瘤细胞中ALK表达及其稳定性，进而增强ALK.CAR-T的靶向作用。与作者猜想的一致，在神经母细胞瘤细胞系以及小鼠模型中，ALK抑制剂lorlatinib可增加ALK表达水平。不仅如此，对于ALK突变和ALK野生型两种细胞系，lorlatinib与ALK.CAR-Ts联用显示出良好的抗肿瘤作用。接着，作者在ALK低表达小鼠模型中探索lorlatinib和ALK.CAR-Ts联用的活性。SK-N-SH神经母细胞瘤转移小鼠接受lorlatinib处理4天，然后接受ALK.CAR-Ts或GD2.CAR-Ts输注，然后再次接受lorlatinib处理5天，共2个周期。结果显示，ALK.CAR-Ts与lorlatinib联用显著减缓肿瘤生长速度并延长生存期（图3）。类似的结果在另外两种神经母细胞瘤转移模型（NGP和SH-SY5Y）中也同样得到验证。图3.对于ALK和GD2低表达的神经母细胞瘤(SK-N-SH)，ALK抑制剂lorlatinib与ALK.CAR-Ts联用显著减缓肿瘤生长速度并延长生存期最后，作者在Felix-PDX模型中验证了lorlatinib和ALK.CAR-Ts联用的疗效。Felix-PDX小鼠 接受CD19.CAR-Ts、ALK.CAR-Ts或GD2.CAR-Ts输注单用或联合lorlatinib。与之前的结果一致，lorlatinib和ALK.CAR-Ts联用显著减缓Felix-PDX模型中肿瘤生长并延长生存期（图4）。
图4.对于Felix-PDX模型，lorlatinib和ALK.CAR-Ts联用显著减缓肿瘤生长并延长生存期安全性方面，与ALK.CAR-T细胞治疗单用的小鼠相比， lorlatinib联合治疗的小鼠T细胞在小肠和大肠中的浸润增加，但其大脑中T细胞浸润无影响。而肠道T细胞浸润增加是否具有远期毒性仍需进一步研究。整体而言，因为ALK在正常组织中几乎不表达，ALK.CAR-T 细胞单用或与lorlatinib联用未发现明显毒性。综上，本研究开发了一款新型选择性靶向神经母细胞瘤ALK.CAR-T细胞，其活性与肿瘤细胞表面ALK受体的表达量相关。ALK.CAR-Ts可快速且深度清除ALK高表达的转移性神经母细胞瘤；而对于ALK低表达的肿瘤，ALK.CAR-T与ALK抑制剂lorlatinib联用可以显著提升其抗肿瘤活性。这项研究结果为进一步在临床上验证ALK.CAR-Ts治疗难治性/复发性神经母细胞瘤患者奠定了基础。值得注意的是，对于ALK低表达的肿瘤，联合疗法治疗后仍然有小部分ALK表达量极低的肿瘤细胞残留。因此，对于如何进一步优化ALK抑制剂的剂量以及给药周期，如何提高ALK的表达等问题，仍值得进一步探索。撰文
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Selection of the best tumor antigen is critical for the therapeutic success of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in hematologic malignancies and solid tumors. The anaplastic lymphoma kinase (ALK) receptor is expressed by most neuroblastomas while virtually absent in most normal tissues. ALK is an oncogenic driver in neuroblastoma and ALK inhibitors show promising clinical activity. Here, we describe the development of ALK.CAR-T cells that show potent efficacy in monotherapy against neuroblastoma with high ALK expression without toxicity. For neuroblastoma with low ALK expression, combination with ALK inhibitors specifically potentiates ALK.CAR-T cells but not GD2.CAR-T cells. Mechanistically, ALK inhibitors impair tumor growth and upregulate the expression of ALK, thereby facilitating the activity of ALK.CAR-T cells against neuroblastoma. Thus, while neither ALK inhibitors nor ALK.CAR-T cells will likely be sufficient as monotherapy in neuroblastoma with low ALK density, their combination specifically enhances therapeutic efficacy.
DOI: 10.1016/j.ccell.2023.11.004
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