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刘亮课题组解锁Cas9反式切割活性并开发新型核酸检测工具 |《自然-生物技术》论文

NBT自然-生物技术2024年06月13日约 3 分钟

研究背景

近年来，随着V型和VI型CRISPR-Cas系统效应核酸酶反式切割活性的发现，CRISPR检测技术在分子诊断领域受到了广泛关注。其中，基于Cas13a的反式ssRNA切割活性和Cas12a的反式ssDNA切割活性开发的SHERLOCK和DETECTR等检测系统，可用于快速、灵敏、特异地检测目标核酸分子。Cas9作为II型CRISPR-Cas系统的效应核酸酶，凭借其高效的核酸靶向和顺式切割活性，成为了目前基因编辑领域使用广泛的核酸操作工具。与Cas12a和Cas13a不同，之前的研究表明，sgRNA引导的Cas9仅具备顺式切割dsDNA的活性，而不具有反式切割核酸的能力。

研究结果

厦门大学刘亮教授课题组发现crRNA与tracrRNA引导的Cas9在识别目标核酸后展现出高效的反式切割活性，并以此开发了两款名为DACD（DNA-activated Cas9 Detection）和RACD (RNA-activated Cas9 Detection)的核酸检测工具。研究人员首先通过结构比较发现，当Cas9与sgRNA和target ssDNA组装后，其HNH结构域和RuvC结构域参与形成的通道具备容纳非目标ssDNA的潜力。研究人员因此怀疑可能需要序列和结构特异性的底物与该通道结合才能使Cas9进行反式切割。通过对核酸底物进行筛选发现，体外条件下，target DNA可以激活Cas9-sgRNA复合物反式切割poly T或poly C ssDNA。既往研究表明，采用嵌合的sgRNA替代crRNA-tracrRNA对Cas9顺式切割target DNA不会产生显著影响。然而，在探究sgRNA替代方案是否影响了Cas9的反式切割活性时，研究人员发现，在crRNA-tracrRNA双引导RNA的协助下，Cas9的反式切割活性得到了显著提高。进一步研究发现target ssDNA、target dsDNA和target ssRNA均可有效地激活Cas9反式切割非目标ssDNA或ssRNA底物。通过与核酸扩增技术相结合，DACD和RACD均可在短时间内对含有猴痘病毒B6R基因的质粒实现精准检测，检测极限分别可达到24和2.4 拷贝/微升。另外，在选取的靶序列仅存在单碱基差异的情况下，DACD和RACD成功对来自猴痘病毒刚果毒株和西非毒株的B6R基因实现了差异区分。

图1. 基于Cas9反式切割活性的核酸检测工具（a）DACD和（b）RACD

与Cas12a和Cas13a相比，Cas9在无需依赖扩增的情况下即可实现对ssDNA、dsDNA和ssRNA的精准识别，因此也大大降低了Cas9检测技术在目标序列的选取时对PAM或PFS的依赖性。另外，Cas9在检测中提供了基于ssDNA或ssRNA探针的多选方案。根据底物偏好性的不同，基于Cas9反式切割活性的核酸检测平台有望与Cas12a和Cas13a联合，以实现对多靶点目标核酸的快速、便捷且精准的检测。

作者简介

厦门大学生命科学学院刘亮教授为该论文的通讯作者。课题组主要致力于核酸加工与修饰的机制研究以及新型核酸操作工具的开发和应用。课题组助理教授陈霁云，2022级博士研究生陈莹，2021级博士研究生黄玲珑为本文的共同第一作者。

Nature Biotechnology

DOI: 10.1038/s41587-024-02255-7

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Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding

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