日本科学家部分实验错误｜小菜一碟

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα和β亚型在哺乳动物睡眠调节中的不同作用

杨蔚文1,2，石婧熠2，李成钢1,2，杨靖群1，余建军1,2，黄娟1,2，饶毅1,2,#

1Chinese Institute of Brain Research, Beijing (CIBR), and Chinese Institutes for

Medical Research, Beijing (CIMR), Capital Medical University, Beijing, China.

2Laboratory of Neurochemical Biology, Peking-Tsinghua-NIBS (PTN) Graduate

Program, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced

Interdisciplinary Studies, PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, School

ofLife Sciences; Department of Chemical Biology, College of Chemistry and

Chemical Engineering; School of Pharmaceutical Sciences at the Health Sciences

Center, Peking University, Beijing, China;

#通讯作者

摘要

睡眠在生物体中具有重要功能，但我们对其分子机制的理解仍然有限。在过去二十年中，包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）α和β在内的多种蛋白激酶被认为与睡眠调节密切相关。在所有已知的小鼠基因突变体中，注入针对Camk2b的sgRNA对胚胎中进行遗传改造的小鼠表现出最显著的睡眠变化：这些小鼠在24小时内的睡眠时间减少约120分钟。我们通过常规基因靶向技术敲除Camk2a或Camk2b基因的小鼠，重新评估了它们的睡眠表型。尽管Camk2a基因敲除小鼠的基础睡眠有所减少，但Camk2b突变小鼠的基础睡眠则未发生显著变化。无论是Camk2a还是Camk2b的基因敲除，都显著抑制了睡眠剥夺后的睡眠反弹，表明这两种蛋白激酶在睡眠稳态中发挥了作用。综上所述，CaMKIIα在基础睡眠和睡眠稳态中均发挥重要作用，而CaMKIIβ主要在生理上调节睡眠稳态而非基础睡眠，这说明睡眠领域应该进行更加严谨的研究。

引言

遗传学为我们理解睡眠调节的分子机制提供了重要帮助。小鼠的基因突变体在揭示特定基因在睡眠调节中的作用方面尤为重要。最著名的睡眠表型小鼠突变体或许是与食欲素及其受体相关的突变体，这些基因在维持白天清醒状态中至关重要，功能丧失（LOF）突变的小鼠（或犬类和人类）则表现出典型的发作性睡病伴随猝倒现象。另一个广为人知的小鼠基因是Sik3，其功能获得（GOF）突变被发现能够增加睡眠。我们在SIK3功能丧失突变体中发现了减少的日间快速眼动（REM）睡眠，与SIK3功能获得突变体的小鼠睡眠增多表型一致。然而，食欲素或SIK3的功能丧失突变体中睡眠减少的程度较为温和：约为24小时内减少30分钟。

与睡眠相关的其他蛋白激酶包括：蛋白激酶A、细胞外信号调节激酶、腺苷酸单磷酸活化蛋白激酶、钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）α和β、c-Jun氨基末端激酶以及肝激酶B（LKB1）。其中，CaMKIIβ基因敲除小鼠显示出最显著的睡眠变化：在24小时内睡眠减少超过120分钟。这一变化大于所有其他已知小鼠突变体的变化。因此，Camk2b敲除小鼠似乎是进一步研究睡眠调节的最重要的突变模型。我们构建了胚胎基因敲除小鼠，并在回交后测试了其睡眠行为，但未能验证先前报告的功能快速筛查结果。

结果

通过传统方法对Camk2a和Camk2b进行基因敲除

为了研究睡眠中的蛋白质磷酸化，我们构建了Camk2a和Camk2b基因敲除小鼠（图1A,B）。尽管先前有研究通过胚胎注射单一引导RNA(sgRNA)来创建Camk2a和Camk2b的功能缺失突变体，以进行快速功能筛查，我们则采用了sgRNA定向基因编辑方法，创建了可遗传的突变体，并进行了至少六代的杂交，再进行功能测试。我们删除了Camk2a基因的外显子5和6，这些外显子编码了氨基酸残基92到137，并引入了一个移码突变，将CCU（脯氨酸）替换为CUG（亮氨酸），导致后续的蛋白质乱序（图1A）。该移码突变覆盖了先前文献中删除的所有氨基酸序列。我们还删除了Camk2b基因的外显子7和8，这些外显子编码氨基酸139到200，并引入了一个移码突变，将GGGGUG（甘氨酸-缬氨酸）替换为GGGUGA（甘氨酸-*），同样覆盖了先前研究中删除的所有序列。通过使用抗体检测CaMKIIα和CaMKIIβ蛋白的Westernblot分析确认了在杂合突变小鼠和纯合突变小鼠中Camk2a和Camk2b基因敲除的有效性（图1C,D）。此外，CaMKIIα或CaMKIIβ敲除小鼠之间并未出现互补现象（图1C,D）。作为行为学对照，我们在Morris水迷宫中测试了Camk2a和Camk2b基因敲除小鼠，确认它们存在缺陷（补充图S1A,B）。

Camk2a和Camk2b在睡眠稳态中的作用

我们还进行了睡眠剥夺（SD）实验，并分析了在6小时SD后，突变小鼠的睡眠反弹情况。在Camk2a敲除小鼠中，未观察到非快速眼动睡眠（NREM）反弹或清醒时长减少的显著变化（图2A, B）。在14到20小时后，发现REM睡眠反弹略有下降；然而，在SD后24小时，未观察到显著差异（图2C）。在Camk2b敲除小鼠中，尽管在13到17小时后，累积的NREM反弹和清醒时长减少略有下降，但与野生型小鼠相比，SD后24小时的睡眠反弹未出现显著差异（图2D, E）。并且，累积REM反弹也未显示出差异（图2F）。

接着，我们分析了突变小鼠在SD前后NREM δ波功率密度的变化。在Camk2a+/+、Camk2b+/+、Camk2a+/−和Camk2b+/−小鼠中，NREM睡眠期间的δ波功率在SD后显著增加（补充图S3A–D），而在Camk2a−/−和Camk2b−/−小鼠中，NREM δ波功率密度未发生显著变化（补充图S3E和S3F）。这一结果表明，在Camk2a−/−和Camk2b−/−小鼠中，SD后的δ波功率的稳态反弹受到抑制，这与它们在稳态反弹睡眠时长上的减少相一致。

我们进一步检查了CaMKIIα和CaMKIIβ活性是否受到SD的调节。CaMKIIα-T286和CaMKIIβ-T287的自磷酸化已知可作为其活性的指示。免疫印迹分析显示，在6小时SD后，CaMKIIα和CaMKIIβ的蛋白质水平未发生显著变化（图2G, I和K），但CaMKIIβ-pT287磷酸化显著增加（p = 0.0286）（图2J），而CaMKIIα-T286磷酸化未发生显著变化（图2H）。目前尚不清楚，CaMKIIα-T286磷酸化未出现变化的原因是抗体的灵敏度不足，还是CaMKIIα-T286在大脑中磷酸化CaMKIIα总量中所占比例较低，亦或是CaMKIIα磷酸化确实没有发生变化。

讨论

我们的研究结果表明，CaMKIIα参与基础睡眠和稳态睡眠反弹的调控，而CaMKIIβ则主要参与稳态睡眠反弹的调节。我们未能重现先前关于CaMKIIβ在基础睡眠调节中发挥作用的发现。正如预期，CaMKIIα和CaMKIIβ突变小鼠均表现出学习缺陷。我们的研究还强调了采用传统的基因靶向技术并在靶向基因后回交多个世代的重要性。

对于先前结果和我们当前结果之间的差异，可以有多种解释。作为一种数量性状，睡眠不仅对遗传背景敏感，还受环境因素的影响，如环境温度、食物类型、社会条件和环境丰富度等；记录设备和手术方法的差异也可能影响表型。然而，如果这些因素的适度差异导致基础睡眠差异接近2小时，这对该领域来说将是不利的。

另一种解释是，尽管先前的研究通过胚胎注射sgRNA快速生成突变体并在同一代进行功能测试，我们则采用了传统、可靠且广泛接受的方法，通过几代杂交产生稳定的突变体并在几代后进行功能测试。虽然快速方法节省了时间，但我们的方法更为可靠，并且是绝大多数研究者使用的方法。

方法

小鼠品系

野生型C57 BL/6J小鼠（8-10周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司或中国脑研究所实验动物资源中心。CaMKIIα和CaMKIIβ敲除小鼠通过CRISPR-Cas9基因靶向技术构建。对于Camk2a，小鼠gRNA序列设计为5′-CTGGATCACGAAGACCCCTG-3′和5′-ACCTGAAGGTGAGTAACCCT-3′，用于删除第5和第6外显子。对于Camk2b，小鼠gRNA序列设计为5′-TCTAGGACCTCCATGTTGGG-3′和5′-TAAGACCTGTGTGTGAGAGG-3′，用于删除第7和第8外显子。将Cas9表达mRNA与sgRNA混合物通过电转染注入受精卵中，然后将受精卵移植到代孕母鼠的子宫中。F0和F1小鼠通过PCR基因分型以确保重组存在。Camk2a−/−小鼠的基因分型引物为5′-AGGGGACAGAGAGGGGTAAG-3′和5′-ACAGGGCAGCCTCAGTCTAA-3′。Camk2b−/−小鼠的基因分型引物为5′-CAGGCCTACGATGGAGATGT-3′和5′-ATCCTGGTGTCCACTTGCTC-3′。突变系经过至少5代的回交到C57 BL/6J背景，以排除可能的脱靶效应。

小鼠饲养

所有实验程序均遵循相关指南，并获得了中国脑研究所动物护理与使用委员会的批准。我们遵守了所有关于动物使用的伦理规定。小鼠维持在C57 BL/6J背景下。小鼠在12小时明暗周期下饲养，并保持在控制的温度和湿度条件下。食物和水供给自由采食。所有实验中使用的小鼠年龄为10-14周。

脑电图（EEG）与肌电图（EMG）记录与分析

EEG和EMG数据的记录与分析方法参考我们之前的研究20。在基础睡眠状态下，EEG和EMG数据记录为期2天，采样频率为200 Hz，每个时段为4秒。EEG和EMG数据初步处理使用AccuSleep39软件，然后在SleepSign中进行手动修正。EEG和EMG信号被分类为清醒（快速且低幅度的EEG，高幅度且可变的EMG）、NREM（高幅度且1-4 Hz主导频率的EEG，低EMG张力）和REM（低幅度且6-9 Hz频率的EEG，EMG完全静止）。状态事件定义为至少连续三段统一的状态时段。包含运动伪影的时段虽然纳入了睡眠时长分析，但在后续的功率谱分析中被排除。对于功率谱分析，EEG数据进行快速傅里叶变换（FFT）分析。功率谱表示EEG信号在24小时基线状态下每0.25 Hz到总0-25 Hz的平均比率。NREM δ波功率密度表示每小时内delta功率密度（1-4 Hz）与总功率（0-25 Hz）之比。累积反弹表示与基线条件下相对ZT时间点比较，睡眠剥夺后累计时间的变化。通过比较睡眠剥夺后NREM δ波密度与基线在相同ZT时间点（ZT6-ZT12）的差异，计算睡眠剥夺前后的变化。对于每只小鼠，睡眠剥夺后六小时的NREM δ波密度与基线进行比较。

Morris水迷宫

空间学习和记忆通过Morris水迷宫的隐匿平台版本进行评估40,41。实验使用一个直径为150 cm的圆形水池，水池中加入不透明水（21 ± 2 °C），水深为35 cm，确保平台不可见。水池被划分为四个象限，逃生平台固定放置在SE象限中心，位于水面下1 cm。数据收集通过连接到图像追踪系统的数字摄像机进行。实验的第一天，小鼠进行1分钟的自由游泳。之后，小鼠每次实验前提前1小时进入水迷宫房间适应环境。在连续6天的实验中，小鼠每天进行四次实验，每次实验间隔30分钟。小鼠从面对水池墙壁的位置开始，每次的起始位置随机分配。小鼠最多有60秒时间找到平台。若小鼠在60秒内到达平台后，允许其在平台上停留10秒。若小鼠在60秒内未能找到平台，工作人员会轻轻引导小鼠到平台上，并允许其停留15秒。分析小鼠到达平台所需的时间。

睡眠剥夺

在连续2天记录EEG和EMG信号后，将小鼠置于新笼中，时间点为ZT0。通过轻触或轻柔处理，保持小鼠在6小时的睡眠剥夺期间清醒，之后将其返回记录笼并继续记录24小时。

脑样品制备与免疫印迹

按照指定的ZT，快速解剖小鼠大脑，用PBS冲洗后立即用玻璃组织匀浆器在4 ml裂解液（50 mM Tris, 1.0% Triton X-100，pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5%去氧胆酸钠）中匀浆，加入新鲜配制的蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）。匀浆液在冰上孵育20分钟后，进行12,000 rpm离心20分钟，收集上清液并稀释4倍进行免疫印迹。

Western blot按照标准程序进行。使用的抗体根据厂家说明书的最佳浓度进行稀释。本研究中使用的抗体包括抗-β-actin抗体（ab213262，Abcam）、抗-CaMKIIα抗体（#11945，Cell Signaling）、抗-CaMKIIβ抗体（ab34703，Abcam）、抗-磷酸化CaMKII（Thr286）抗体（#12716，Cell Signaling）、抗-CaMKII抗体（#4436，Cell Signaling）。使用ImageJ计算灰度值。

统计与重复性

所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0软件进行。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较三个以上组间的差异，并进行Tukey多重比较检验。非参数检验采用Kruskal-Wallis检验。对于不同处理组间的差异，采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），并进行Tukey多重比较检验。对于相同个体多次测量相同结果变量的情况，采用双因素重复测量方差分析（Two-way RM ANOVA），并进行Tukey多重比较检验。数据以均值±标准误（SEM）表示。在所有情况下，p值大于0.05被认为无统计学意义。

表1 |Camk2a基因敲除雄性小鼠在不同睡眠-觉醒状态下的总时间

表2|Camk2b基因敲除雄性小鼠在不同睡眠-觉醒状态下的总时间