伴随基因科学与治疗技术的进步，基因疗法正日益成为预防和治疗遗传病、传染病以及肿瘤等重大疾病的前沿创新手段。近年来，多种细胞和基因治疗药物相继获批上市，显示了该领域的蓬勃发展与巨大潜力。作为基因治疗技术的核心环节，高效且安全的基因递送系统的开发至关重要，不仅能有效保护基因载荷的完整性，还克服了体内递送过程中复杂的生物屏障，为实现基因疗法的临床转化提供关键支撑。病毒载体（如AAV和rAAV）现已广泛用于基因治疗，不过也面临着免疫反应风险、潜在的插入突变风险、基因递送尺寸受限制以及生产成本高昂等挑战。而非病毒递送系统凭借更低的免疫原性和更高的安全性，成为具有广阔前景的替代方案。为了满足学术研究和工业研发对高性能基因递送系统日益增长的需求，科学家们迫切需要开发兼具体外和体内应用能力，并能实现高效、安全转染的递送载体。在一项近期发表于International Journal of Molecular Sciences的研究中，N1 life公司的研究团队系统性地报道了新型生物可降解载体材料N1-501在RNA转染领域的应用及其使用方法优化过程，这种材料能通过简便的实验步骤实现高效的RNA递送，并同时适用体外和体内的转染需求。本文为该技术的科研和工业使用者提供了明确的操作指南。研究指出，N1-501的开发为基因治疗领域提供了一个可加速从实验室研究到临床前研究过渡的高效解决方案。它不仅能降低研发成本，还能显著提高转化成功率，为基因治疗的进一步推广与应用开辟了新路径。N1-501在多种细胞系的转染实验中都显示出良好的转染效果和安全性。为了评估其mRNA递送性能，研究人员选择了18种常用的细胞系。N1-501在所测试的上皮细胞系和成纤维细胞系中表现出优异的转染效率。在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞中，超过80%的细胞表达了绿色荧光蛋白，这一递送率对于难转染的免疫细胞系来说尤为突出。此外，N1-501的安全性也在大多数癌细胞、脑细胞和成纤维细胞系中得到了验证。▲N1-501能够高效地将mRNA递送至多种细胞系中，并表达成蛋白质（图片来源：参考资料[1]）N1-501可以同时实现体内体外的转染。研究人员评估了N1-501在体内系统性递送荧光素蛋白mRNA的性能。研究人员在给药后3、6和12小时注射D-荧光素，并对小鼠进行全身成像以评估各时间点的荧光素酶蛋白表达。结果表明，N1-501给药组在所有时间点均表现出优异的脾脏选择性，总荧光信号在3到12小时之间逐渐减弱。离体成像进一步证明了mRNA递送的器官和组织选择性。荧光信号主要分布在脾脏、肺和肝脏中，其中脾脏的荧光强度比肺和肝脏高出两个数量级，说明N1-501在mRNA递送方面具有显著的脾脏靶向能力。▲N1-501体内转染高效安全，且表现出显著的脾脏靶向性（图片来源：参考资料[1]）N1-501可以通过简单的移液枪混合方法包封mRNA，也可以使用振荡器辅助混合和包裹。其良好的水溶性特征使整个配制过程能够在水相系统中进行，无需添加任何有机溶剂或缓冲液。将N1-501与稀释后的mRNA在无RNA酶水中混合后，纳米颗粒可通过自组装形成，样品在室温下预孵育3分钟后即可用于细胞转染。体内制剂需调至1X PBS浓度再用于动物实验。与移液枪混合法相比，振荡混合法能提供更均一的粒径。两种方法均易于操作，可以在标准的实验室条件下进行。▲N1-501配制转染复合物的流程图示（图片来源：参考资料[1]）- 为RNA递送提供广泛的操作窗口，适用于不同RNA剂量范围
细胞转染率、mRNA 表达水平和细胞活力是评估 mRNA 转染的三个关键标准。RNA剂量在不同应用中会根据研究目标和实验设置有很大差异。为了探索安全窗口和功效范围，研究人员在HEK 293T细胞中测试了不同的mRNA和N1-501剂量组合，以观察不同剂量对于RNA转染的影响。结果显示，GFP蛋白表达水平（以平均荧光强度，MFI表示）与mRNA剂量呈正相关性。如果mRNA 剂量过高，可通过降低N1-501/mRNA 比例以平衡功效和安全性。值得注意的是，N1-501在所测试的所有mRNA剂量条件下的转染效率均在96%以上。这些结果可为研究人员提供参考，以确定特定应用场景中的边界条件和最佳剂量范围。▲N1-501在不同mRNA和载体剂量组合下的转染性能和安全性（图片来源：参考资料[1]）生理缓冲液在基因递送中也起着多种作用，比如基因载荷和制剂的储存、配方工艺开发等。具有特定pH范围的缓冲液对维持基因载荷的稳定性和功能至关重要。它们还会影响可离子化递送材料的电荷，从而影响纳米颗粒的包封效率、粒径、均一性和稳定性。在本作者在配方开发过程中测试了四种常见的生理缓冲液——柠檬酸盐（pH 4.0、5.0和6.0）、醋酸盐（pH 4.0、5.0和6.0）、磷酸盐缓冲盐水 (PBS，pH 7.4) 和HEPES（pH 8.0）。由N1-501递送的eGFP mRNA在细胞内的表达水平显示出明显的pH 依赖性：在pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液中制备的纳米颗粒产生了最高的MFI，在pH 5.0 和pH 4.0中信号依次减弱；醋酸盐缓冲液显示出类似的趋势。在pH 7.4的PBS和pH 8.0的HEPES缓冲液中的MFI与在水中的表现相近。值得注意的是，转染效率在所有缓冲液和pH条件下无显著性差异，表明N1-501在各种缓冲体系下具有良好的稳定性和适应性。N1-501还具有良好的血清耐受性。血清可能会引入RNA酶污染、或与载体竞争细胞表面受体阻止其进入细胞、或影响载体/mRNA复合物的稳定性，从而干扰 mRNA 转染。因此，实验中通常会使用无血清或降血清的培养基（如Opti-MEM）以获得最佳的转染性能。然而，这些条件对于需要维持一定血清浓度的应用和（或）细胞系不适用。本研究中，N1-501能够在有血清的条件下成功转染细胞，且不同缓冲液体系、pH范围和培养基条件对细胞活性基本没有影响，证明了 N1-501在各种配制和处理条件下具有良好的安全性。▲N1-501在配制和转染过程中缓冲液及培养基的兼容性（图片来源：参考资料[1]）纳米颗粒配方的稳定性和可重复性对于mRNA转染实验至关重要。稳定的纳米颗粒能够保持mRNA 的完整性，并能简化制剂的使用和运输。此外，稳定的制剂还可以支持时间密集型任务，例如高通量实验和需要用同一个样品进行多种实验的情况。稳定且一致的配方不仅能保持转染效果，还能提高实验成功率，确保结果的可靠性和可重复性。结果表明，在0°C或25°C 下孵育长达60分钟的N1-501/mRNA复合物作用于细胞后转染效率仍然超过98%；样品在37°C下孵育一小时后，表达GFP蛋白的细胞比例仍保持在95% 以上。各条件下恒定的高转染效率表明N1-501材料包裹RNA的能力卓越，可以确保纳米颗粒优异的稳定性和重复性，可适应高通量实验、转化研究或其他复杂研究中可能出现的不均一性。▲N1-501与mRNA样品制备后在三种不同温度下预孵育不同时间不影响转染效果（图片来源：参考资料[1]）本文基于体外转染效率评估了N1-501的保质期。不同于一些市售的LNP技术相关的载体分子，例如阳离子脂质等分子，N1-501及储备液（2.5 mg/mL，无RNA酶水）不需要在-80°C下储存。常规使用情况下，N1-501储备液可保存在4°C 下，而长期内不使用则可以放置于-20°C下保存（超过5年）。N1-501储备液经过多次冻融后（>30次）仍然保持其生物活性即出色的RNA转染能力。此外，室加速稳定性实验结果表明N1-501在4°C下可保存至少两年时间。N1-501作为一种新型RNA递送材料，在多方面展现了其优异的特性，在体内和体外、不同的实验条件、不同的保存条件下均能保持稳定高效的RNA转染能力；其制备过程简单，可在标准实验室条件下完成，且制剂在一定温度范围（0–37 °C）下保持稳定，确保了实验结果的一致性和可重复性，同时简化了操作流程。N1-501能兼容多种生理缓冲液，适应广泛的pH范围（pH 4.0–8.0），且在mRNA转染过程表现出血清耐受性，增强了其在复杂生物环境中的实用性。值得注意的是，在一定范围内，无论RNA剂量高低，都可通过调整N1-501的使用比例实现高效的转染效率，拓展了其在不同递送需求下的应用潜力。N1-501能够高效转染多种细胞系，包括上皮细胞、成纤维细胞和脑细胞，展现了其广泛的有效性。N1-501在基因编辑方面也表现出色，在体外递送Cas9 mRNA和sgRNA时，编辑效率高达96%。更重要的是，N1-501在体内系统性递送mRNA中表现出优异的脾脏靶向性，这一独特性使其在桥接实验室研究与临床应用的转化过程中有多重优势，有望加速RNA疗法和技术的研究和开发。N1 Lab科研产品由来自硅谷的N1 Life团队开发，转染试剂技术源自斯坦福大学院士实验室，N1 Life由美国三院院士Paul Wender教授与斯坦福大学臧晓羽博士共同创立，旨在将前沿药物递送技术转化落地为医疗和科研产品。[1] Yang, X.; Xiao, J.; Staveness, D.; Zang, X. Efficient mRNA Delivery In Vitro and In Vivo Using a Polycharged Biodegradable Nanomaterial. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 13620. https://doi.org/10.3390/ijms252413620免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
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