隐藏在细胞中的“暗蛋白质”：帮助研究癌症和其他疾病？

原文作者：Ewen Callaway

本篇《自然》长文共4699字，干货满满，预计阅读时间14分钟，时间不够建议可以先“浮窗”或者收藏哦。

人类基因组可能编码了数千种此前未获重视的微小蛋白质。本文致力于探究它们在人体中发挥的作用。

2009年，Jonathan Weissman正在寻找一种新的方法来探究细胞内部发生了什么。具体而言，这位分子细胞生物学家想知道，在任何特定时刻产生了哪些蛋白质。他的实验室开发了一种方法，直接测量核糖体（细胞的蛋白质工厂）的产出。

这种方法是与当时的博士后、现就职于加州大学伯克利分校的Nicholas Ingolia共同开发的，包括收集细胞的所有核糖体，并对与之结合的单链信使RNA进行测序。研究人员希望这种被称为核糖体分析的工具能准确统计出细胞制造的所有蛋白质及其相对数量。

但当Weissman和其他人开始尝试这种方法时，他们发现了一个巨大的惊喜。核糖体不仅忙着制造细胞基因组中已知基因编码的蛋白质，而且似乎还在制造成千上万种“暗蛋白质”，对应到基因组中被认为不会产生蛋白质的部分[1]。马萨诸塞州剑桥市怀特海研究所的Weissman说：“这是我们的‘啊哈！’时刻”。很快，他的实验室和其他实验室就在他们研究的几乎所有生物体中发现了意想不到的翻译事件。

15年过去了，科学家们仍未透彻理解这些蛋白质。

暗蛋白质往往很短，通常仅由几十个甚至更少氨基酸组成。其中许多不常见——它们在其他生物的基因组中没有近似的序列。研究表明，其中一些可能在细胞中发挥重要作用，并可能影响人类健康。它们似乎在某些癌症中大量存在，一些公司希望开发出针对暗蛋白质的治疗方法。但是，对于这些神秘的蛋白质来说，证明它们有重要的作用、甚至它们是否能在细胞中存活很长时间的证据都还很模糊。

加拿大谢布鲁克大学研究蛋白质组学的Marie Brunet说，问题在于科学家们不知道可能漏掉了什么。她说：“如果储存库中缺少一种蛋白质，你甚至都不会去寻找它。”

基因计数困难

Brunet参加了一项全球工作，记录人类基因组编码的所有暗蛋白质（见“探索暗蛋白质组”）。这项工作的目的是吸引研究人员对这些暗蛋白质的关注，以便他们能够开始逐个分子地研究这些蛋白质在做什么。

荷兰乌得勒支马克西马公主儿科肿瘤中心的系统生物学家Sebastiaan van Heesch说，前景令人振奋，他也是这项工作的参与者之一。他说：“里头肯定有新的生物学。”

本世纪初人类基因组首次公布之前，研究人员狂热地研究新出现的序列数据，试图估算出蛋白质编码基因的数量。通常，他们寻找的是所谓开放阅读框（open reading frames ，ORF），即带有特定三字母序列（即密码子）的代码段，其中可能包含生产蛋白质的指令。基因组学家们还寻找更多的线索，如序列在其他生物体内是保守的、长度合理的证据，所有这些都表明所产生的蛋白质在细胞中可能具有某种功能。

随着生物学家不断完善他们的评估，许多不符合这些标准的ORF被忽视或漏掉了。维护预测基因列表的联盟（如GENCODE项目）目前列出了近2万个蛋白质编码基因。其中约90%的基因已经通过其他手段得到证实，可以产生相应的蛋白质（单个基因可以通过包含或省略称为外显子的代码段来编码多种不同的蛋白质）。GENCODE和其他项目会根据新出现的数据定期调整它们的列表。

但是，据密歇根大学医学院癌症生物学家John Prensner称，清单并不完整。认为研究人员早在2001年就能列出一份完整的蛋白质编码基因清单的想法，是一种常见误解。Prensner说：“人类基因组计划的领导者们一直都知道，这只是开始了一场对话。”

由于能够直接测量核糖体的产出，人们对被忽视的ORF及其编码工作蛋白的潜力产生了浓厚的兴趣。在2022年发表在《自然-生物技术》上的一篇文章中，由Prensner、van Heesch等人共同领导的研究小组列出了一份7000多个“非经典”ORF的清单，这些ORF通常不符合被认为是蛋白质编码基因的要求，因此被从数据库中省略了[2]（van Heesch说，这只是下限；其他研究已经发现了人类基因组编码的数以万计的潜在暗蛋白）。

科学家们列出的大多数非常规ORF要么邻近经典蛋白质编码基因，要么与之重叠（见“暗蛋白质在哪里？”）其中约三分之一的ORF存在于被称为长链非编码RNA的序列中，顾名思义，长非编码RNA不会编码蛋白质，但被认为具有调控作用。

但是，ORF被翻译成蛋白质并不意味着这些蛋白质是稳定的或在细胞中具有重要作用。Prensner等人说，由核糖体完成的某些非经典ORF的翻译，可能是细胞控制临近基因活性的一种方式。例如，用很快就会被降解的产物减缓核糖体发挥作用。这种控制发生在某些出现在蛋白质编码序列之前的上游ORF中。

在2022年论文之后的一项预印本研究中，Prensner、van Heesch和一个由基因组学和蛋白质组学专家组成的扩大联盟，梳理了数百个蛋白质组学数据集（包括数十亿个数据点），及使用使用质谱或其他方法识别细胞蛋白质含量的研究结果[3]。研究人员找到了与他们在2022年发现的1700多个非经典ORF相符合的蛋白质片段。研究人员认为，其中有15个蛋白质片段证据确凿，有理由将这些蛋白质及其对应的基因加入正式的蛋白质编码基因统计中。

但是，对于大多数非经典ORFs来说，还缺乏明确的证据证明它们能够产生蛋白质。部分原因是潜在蛋白太小——研究人员称它们为微蛋白，因为它们往往远不到100个氨基酸（人类蛋白质平均含有几百个氨基酸，许多蛋白质甚至更长）。由于它们的长度很短，因此很难找到匹配的片段——后者是在实验中产生的，实验中蛋白质被分解，并根据其分子量来识别蛋白质片段。Van Heesch说，细胞样本中较长蛋白质的片段比例会过高，尤其是在微蛋白含量较低的情况下。

当科学家们使用名为AlphaFold的人工智能工具预测暗蛋白质的结构时，这些分子往往与折叠良好的蛋白质几乎没有相似之处。但是，Presner说，“有一些明显的例子表明，（暗蛋白质）非常像经典蛋白质，只是被漏掉了”。GENCODE和其他管理储存库的组织已经开始将这些被忽视的蛋白质添加到列表中。

Jonathan Mudge在英国欣克斯顿的欧洲分子生物学实验室的欧洲生物信息学研究所负责GENCODE项目，他也是预印本的合著者之一。他表示通过核糖体分析确定的约50个序列已被列入人类蛋白质编码基因列表。

但他补充说，他们的推进很谨慎。Mudge说不仅有实验室生物学家依赖GENCODE这样的数据库来解释实验，临床医生也依赖这样的数据库，如果增加大量可疑的蛋白编码基因，可能会使识别病人基因组中有害变异的工作复杂化。“我们不是多疑，只是比较谨慎。”

编辑蛋白

就在研究人员开始关注基因组编码暗蛋白的潜力时，另一项技术突破使系统研究暗蛋白在细胞中的作用成为可能：CRISPR-Cas9基因编辑技术。Weissman说：“突然我们就能切掉这些非经典蛋白的编码序列，然后看，它们对细胞的功能重要吗？”。

在2020年的一篇《科学》论文中，Weissman的团队证明了这一点。研究人员利用CRISPR基因编辑技术干扰了数千个非经典ORF，阻止它们在人类诱导多能细胞和癌细胞系中翻译成蛋白质[4]。在数百个实例中，CRISPR编辑导致细胞出现生长缺陷。Weissman说：“许多微蛋白对细胞来说非常重要”。

通过进一步的实验，他们终于找到了原因。在某些情况下，非经典ORF编码的蛋白质与同一mRNA链上编码的蛋白质相互作用。Weissman说，这让人联想到共同调控的细菌基因往往在称为操作子的单元中彼此相邻。他的团队鉴定出的功能性暗蛋白在细胞中扮演着不同的角色：一种似乎参与了细胞周期，另一种参与了线粒体的生理学。

癌细胞可能特别富含暗蛋白质。Prensner同时也是一名儿科神经肿瘤学家，他正在研究人类基因组中的非经典ORF在某些癌症中可能会被误调，这可能会导致他和其他医生所看到的患者不同治疗结果。他说：“我们提出的核心问题是，为什么癌症会产生这些东西”。

在与Weissman类似的实验中，Prensner领导的研究小组发现，他们用CRISPR技术抑制的500多个非经典ORF中，约有10%会导致各种人类癌细胞的生长缺陷[5]。Prensner和他的同事们发现了一种在乳腺癌细胞系中表达水平升高的暗蛋白质，这种蛋白质似乎也在推动这些癌细胞的生长。

在去年发表的一项研究中，Prensner、van Heesch和他们的同事发现了几种促成髓母细胞瘤（有时致命的儿童脑癌）的暗蛋白[6]。在其中一个例子中，研究人员发现，一种独立于邻近ORF编码的经典蛋白的暗蛋白，正在推动一种侵袭性特别强的髓母细胞瘤的生长，这种肿瘤携带过度活跃的MYC 癌基因。

van Heesch说，这些例子只是冰山一角，要想了解暗蛋白质在健康和患病细胞中的运作情况，还需要做更多的工作，这说明有必要让其他科学家注意到这些蛋白质。“研究其中一种暗蛋白质需要三到四年的时间。我们已知有数千种，还有很多相关生物学有待发现”。

选出垃圾

然而，要从这堆可能的蛋白质中挑选出有实际功能的蛋白质是非常困难的。Prensner说：“一种解释是，我们以这种方式观察到的许多蛋白质种类并不稳定或没有功能，它们就像垃圾堆一样。细胞制造出一些氨基酸序列，丢进垃圾压缩机，从另一端吐出来。”

另一个解释是人体内免疫监视系统的存在（在人类中称为白细胞抗原（HLA）复合体），它呈递细胞表面的蛋白质片段。该系统有助于训练免疫细胞不攻击正常组织，并对病毒和癌细胞等威胁发出警报。细胞制造的几乎所有蛋白质链，甚至是那些没有任何功能的蛋白质链，都会以这种方式展示出来。

在人类身上发现的大部分暗蛋白质都是通过一种识别HLA复合体呈递肽链的技术发现的。纽约市哥伦比亚大学的分子生物学家吴雪兵说，研究人员几乎没有发现这些蛋白质的其他功能，这表明它们中的绝大多数是翻译错误，或者只起到调控翻译的作用。他怀疑许多暗蛋白质进入细胞循环系统的速度太快，无法承担任何明确的职责。

在2023年发表的一篇《自然》论文中，吴雪兵和同事发现，许多暗蛋白质都带有一种化学特征，能有效地将它们从核糖体直接送进垃圾堆[7]。

但这项研究还发现了一种机制，能将一小部分暗蛋白质引导到细胞膜上，使其免受降解，并有机会演化出新的作用。在今年早些时候发表的一篇综述[8]中，吴雪兵的团队发现了大约1000种他们认为可能有功能的暗蛋白质。他说，细胞需要在去除可能有问题的暗蛋白质与不扼杀创新之间取得平衡。

科学家们说，即使大多数暗蛋白质没有明确的功能，它们的存在仍然可能很重要。van Heesch说，许多暗蛋白质只有在它们的片段被免疫系统呈递时才被发现，这一事实可能暗示了它们在免疫中的作用。他说，核糖体是一种耗能细胞器，产生这些蛋白质的成本“相当高昂”，“细胞怎么会一再翻译垃圾呢？”

无论暗蛋白质在细胞中干什么，制药公司已开始考虑将之作为有前景的靶点。一些生物技术公司，包括英国牛津的Enara Bio和巴黎的Mnemo Therapeutics，正在开发针对癌细胞产生并由HLA复合体呈递的“暗抗原”的免疫细胞疗法。将于今年在中国启动的一项临床试验将是首批针对暗蛋白质组的临床试验之一。该试验将测试一种疫苗能否提高临床治疗效果，它提醒免疫细胞注意某些乳腺癌产生的暗蛋白质，小鼠实验取得了可靠的结果。

位于马萨诸塞州剑桥市的ProFound Therapeutics公司（Prensner为其提供顾问服务）正与制药巨头辉瑞公司合作，以暗蛋白质组为目标，寻找肥胖症的治疗方法。

不过，就算只谈生物学也让科学家很振奋。一些人推测，暗蛋白质可能代表着演化过程中基因创新的沙盒。Weissman说：“我们可能正在观察一种蛋白质的诞生”。

在2024年发表于《自然-心血管研究》的一项研究中，van Heesch和他的同事们识别了一组暗蛋白质，这些蛋白质似乎出现在灵长类动物和包括人类在内的各种灵长动物世系中，其中一些有助于心脏功能[10]。但创新可能是有代价的。与保守基因相比，这些暗蛋白在心脏病患者的细胞中往往表达失常。Prensner补充说，在正常发育过程中发挥作用的暗蛋白可能会出错，从而引发癌症，尤其是儿童癌症。

发现暗蛋白质组的科学家们说，对于这些分子在细胞中做什么，不会有一个一言以蔽之的解释，答案会像生物学的其他内容一样混乱而复杂。但更重要的是，Prensner、van Heesch及其他志同道合的科学家只是希望生物学家关注蛋白质，少担心它们怎么分类。van Heesch说：“我想提倡的是，少打一些标签去分类。”