CRISPR PRO-LiveFISH活细胞成像技术解析非重复位点染色质动态及增强子互作

研究背景

      三维基因组互作与表观遗传修饰共同调控基因表达，其动态变化与细胞发育及疾病发生密切相关。测序技术和荧光原位杂交技术（FISH）已广泛用于该领域，但主要依赖固定细胞，难以捕捉染色质实时动态。基于CRISPR的活细胞成像方法可靶向内源基因，但在非重复序列，多位点成像及原代细胞中的应用难度较大。

结果与展望

      研究团队将CRISPR技术与拓展遗传密码技术相结合，开发出新型活细胞DNA成像技术CRISPR PRO-LiveFISH（Pooled gRNAs with Orthogonal bases LiveFISH）。该技术在CRISPR LiveFISH基础上，首次引入拓展遗传字母表中的正交非天然碱基对，并结合基于结构的理性设计，实现了sgRNA位点特异性的荧光标记，提升了活细胞DNA标记的灵敏度。

图1：CRISPR PRO-LiveFISH 的设计策略及应用

     PRO-LiveFISH通过整合DNA库与拓展遗传密码技术，利用体外转录及转录后修饰制备高通量、位点特异性标记的sgRNA探针库，实现了非重复DNA序列的高灵敏度活细胞成像，并适用于原代细胞。PRO-LiveFISH可同时对6个不同位点进行多色标记，仅需10条sgRNA可在活细胞中观测非重复序列的实时动态。

      通过对多基因位点的动态观测，研究团队探索了表观修饰和染色质互作相关的动态调控规律。通过比较不同细胞状态、不同细胞类型中同一位点的动态，发现其与表观修饰水平密切相关：活跃的组蛋白修饰（如乙酰化）常伴随着受限的位点运动，而乙酰化下降时位点运动相对增强。对特定增强子及其靶基因进行追踪，发现它们在运动中仍能保持持续的空间邻近，提示增强子-启动子（E-P）互作具有较高的时空稳定性。最后，对超级增强子及其靶基因的追踪显示，转录共激活因子BRD4是维持此类三维互作的关键，当其被抑制时，相应互作显著解离。

      综上，CRISPR PRO-LiveFISH通过结合拓展遗传字母技术与sgRNA理性设计，为动态三维基因组研究提供了新的活细胞多色成像工具，适用于非重复DNA序列的动态标记以及原代细胞成像。借助该工具，研究团队解析了染色质动态与表观遗传修饰的关联、E-P互作的时空特性，以及转录共激活因子在维持超级增强子三维互作中的作用，从而深化了对表观调控与三维基因组时空动态的理解。

作者简介

      清华大学生命科学学院王海峰研究员、颉伟教授以及中科院生物物理所方显杨研究员是本文的共同通讯作者。清华大学博士生刘美铄、黄可韵和张杰（已毕业）为共同第一作者。西湖大学于洪涛教授、戚树涛研究员，清华大学博士后杜振海（现中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员），以及清华大学博士生李青阳、王新铭、顾卜铭、唐昊、马宇、胡梁俊（已毕业）等对研究做出重要贡献。

《自然-生物技术》Nature Biotechnology

DOI: 10.1038/s41587-025-02887-3 

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CRISPR live-cell imaging reveals chromatin dynamics and enhancer interactions at multiple non-repetitive loci

《自然-生物技术》

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