中药化学分子抗癌作用的分子生物学研究:甘草次酸与Warburg效应

【中药的科学研究，是中药发展的必由之路。

但研究中药却不是我实验室的必然工作。我们实际上没有计划做中药的研究。

我做过屠呦呦和青蒿素的科学史，但那是与北大医学部人物学部的张大庆和他的研究生黎润红的合作，与我的实验室无关。

我在北大的实验室，突然研究中药的单体化学分子，完全是误打误撞。我是安排的实验室多个研究生（北大都是直博生，我和一公回国后，北大清华的生命科学已经多年没有硕士生了）筛选一些分子及其作用。朱晨用的一个小分子库，是从国外购买的，发现有作用的分子里面，居然有一个是中药甘草来源的单体化合物甘草次酸（18β-GA）。朱晨观察到某种作用后，因为她还有其他重要观察，所以我请她专注那个课题，她有重要发现（且听明年分解）。我请夏冰心接朱晨的初步发现，研究18β-GA的机理。

18β-GA有抗癌作用，是其他多个研究课题组已经发现并报道的。但它的作用需要什么，并不清楚。

夏冰心用体外培养细胞系可以观察到18β-GA的杀癌细胞作用。这是验证其他人的发现。我安排她去北大魏文胜实验室学习分子生物学筛选方法（CRISPRi），用CRISPR的方法筛选可以抑制18β-GA作用的基因。她学的很快(也说明魏老师实验室的技术特别好，魏老师及其实验室的同事热心教我们）。很快掌握了技术，而且探索不同的检测可能。第一个检测拿不到很可靠的结果，换了第二个方法：看细胞死还是不死。魏老师也说过，用死亡来筛选最有效，我们验证了魏老师的建议。

用18β-GA孵育癌细胞，可以杀死癌细胞。而如果用CRISPRi方法筛选很多sgRNA的时候，有些sgRNA可以阻止18β-GA杀癌细胞的作用。我们把这些sgRNA拿出来，基因测序，然后多次同样筛选，几次都能富集的sgRNA就可能是对于18β-GA杀癌细胞所必需的基因。

我们拿到了多个基因，而且多个可以被反复验证。

在这些基因里面，有两个很有趣：它们有相关性。一个基因编码转运乳酸的蛋白质（学名：乳酸转运体，MCT1）。一个基因编码的蛋白质辅助MCT1。那么这就有趣了。

这时，我们学习文献。

在癌症领域，有一个著名的Warburg效应。这是1923年德国科学家、诺奖得主Otto Warburg发现的。通常，细胞在氧气充足的情况下，进行氧化磷酸化，缺氧的情况下进行糖酵解。Warburg发现，癌细胞氧化磷酸化减少，糖酵解增加。这一效应很快被另外一对诺奖得主所重复，Getty Cori和Carl Cori夫妇马上将这一效应命名为Warburg效应。

后来的研究证明，癌细胞在有氧的情况下，增加了糖酵解，但没有减少氧化磷酸化。所以，Warburg效应的正确表述是：癌细胞在有氧情况下增加糖酵解。

糖酵解是所有学习生物化学的学生都被要求死记硬背的一条通路。我实验室每一个学生都曾经被折磨过。一般难以记住其中的细节，容易记住所谓产生了多少个ATP。但糖酵解很简单的一个结果是：乳酸增加。因为乳酸是糖酵解的必然产物。

癌细胞的糖酵解增加，导致乳酸增加。如果乳酸太多，癌细胞就会被自己酸死。所以，很多癌细胞就通过增加MCT1的表达，把乳酸转运出去。

这就有趣了，癌细胞增加糖酵解，糖酵解增加乳酸，如果癌细胞要避免自杀，就要增加MCT1。

文献读到这里，就太有趣了。我们的发现，意味着甘草次酸可以通过MCT1而进入癌细胞，从而杀死癌细胞。

有了这一假设，夏冰心就做了一系列实验，证明甘草次酸确实是通过MCT1而转运进入癌细胞，从而杀死癌细胞。

这一研究非常有趣，对研究生是很好的科学和技术训练。有偶然，有文献学习，有思考，有技术，有严格的实验。

筛选带来的是惊讶，而不是事先知道结果。实际上，事先只设计了一步实验，后面的实验是根据前面的实验结果而一步一步设计。

像是一个侦探故事。

研究生是侦探，人类对自然的侦探。

这一研究也可以有意义，意义的大小需要时间检验。

一个可能比较大的意义是：甘草次酸的机理，等于是特异针对癌细胞，针对Warburg效应而杀细胞，那就是杀癌细胞。

这一机理提示可以用甘草次酸，或者它的衍生物，或者按这一机理设计其他抗癌药物，增加对癌细胞的特异性，减少副作用。

目前的缺点是：1）MCT1并非甘草次酸杀癌细胞的靶蛋白，只是让甘草次酸进入细胞，靶蛋白应该是其他；2）甘草次酸（18β-GA）本身的抗癌作用不是很强，所以用它不够。

但是，如果改变它的结构，增加抗癌作用，保留特异性，可能就很好。不改变它，而改变一个已知的强效抗癌药，但接上可以通过MCT1的基团，针对Warburg效应，也是一种方法。

还有一种可能，很毒的药物，因为缺乏特异性而副作用很大，但如果接上特定结构，有如甘草次酸的结构，从而专门进入MCT1，可能也可以特异针对癌细胞。

所以，一个研究不仅在于它本身有趣，还在于可以刺激更多的研究和设计】

靶向Warburg效应：乳酸转运蛋白MCT1及其分子伴侣在18β-甘草次酸杀伤癌细胞中的作用

夏冰心     朱晨     饶毅

关键词：

Warburg效应癌症转运蛋白中草药

摘要

甘草是一种常用的中药，其主要成分是甘草酸，衍生产品18β-甘草次酸（18β-GA）具有抗肿瘤活性。本研究通过全基因组CRISPR筛选，确定了18β-GA敏感性所需的基因。我们发现乳酸转运蛋白MCT1及其膜分子伴侣BSG参与了18β-GA对癌细胞的杀伤作用。MCT1对于癌细胞摄取18β-GA是必要且充分的。BSG对于MCT1在细胞膜上的定位是必需的，因此对于18β-GA的摄取以及癌细胞的死亡至关重要。虽然已知癌症的Warburg效应会增加乳酸产生，进而选择更高表达MCT1的癌细胞，通过排出乳酸来增强癌细胞的存活，但我们的研究揭示了一个新的机会，即通过Warburg效应增加癌细胞对18β-GA的敏感性，从而杀死癌细胞。因此，我们的结果揭示了18β-GA敏感性的生物标志物，并暗示了利用Warburg效应使药物进入肿瘤细胞的可能性，这将激发对传统中药的进一步分子机制研究和改进。

1.    引言

在现代医学传入中国之前，传统中药已经为中国保驾护航数千年。其中最常用的中药之一是甘草（Glycyrrhiza glabra），它有着悠久的历史[1,2]。从其根部提取的主要化学物质是甘草酸，经肠道细菌水解后产生18β-甘草次酸（18β-GA）[3,4]。

癌症仍然是全球健康的重大挑战，传统治疗方法常常受到药物耐受性和不良反应的限制。癌症细胞代谢的一个标志是由Otto Warburg在一百年前发现的[5-7]，并很快由Carl和Getty Coris证实[[8-12]。最初认为糖酵解增加而氧化磷酸化减少，但后来的共识是癌症细胞在有氧条件下仅增加糖酵解（“有氧糖酵解”），产生更多的乳酸[5-7,10,11]。

发现新型治疗剂和分子靶点对于推进癌症治疗至关重要。一些值得注意的抗癌药物是从植物中发现的，例如紫杉醇和长春碱，它们最终成为卵巢癌等常见癌症的一线治疗选择[13]。18β-GA已被发现具有抗癌效果[14,15]，对多种癌细胞表现出广谱活性[16-19]。18β-GA可以抑制对癌症生长和转移至关重要的主要途径，例如PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2和Akt/mTORC1/STAT3[14,17,20,21]。尽管对18β-GA的抗癌机制有很多研究，但关于允许18β-GA进入细胞的细胞膜分子基础知之甚少[22-24]。

CRISPR-Cas9提供了一种强大的基因修饰技术[25]，衍生技术是应用CRISPR-Cas9进行基因功能筛选[26-30]。它可以用来寻找药物敏感性和耐药性的机制[29,31,32]。

在这项研究中，我们应用基于CRISPR-Cas9的筛选系统地寻找18β-GA反应所需的基因。我们发现单羧酸转运蛋白1（MCT1，也称为SLC16A1）及其膜分子伴侣basigin（BSG）是18β-GA敏感性所需的。

溶质载体（SLC）有助于细胞质和囊泡转运体。家族16（SLC16）在人类中有14个成员，它们是依赖于电化学Na+或H+梯度的次级主动转运体[33-36]。MCT1是SLC16家族的成员，是一种质子偶联的单羧酸转运蛋白，负责转运乳酸和丙酮酸等单羧酸[37-41]。BSG是MCTs的分子伴侣，对于MCT1、MCT3和MCT4在细胞膜上的定位至关重要[42-47]。在癌症中发现了MCT1的过表达[36,48-56]。MCT1允许乳酸从正在进行有氧糖酵解的癌症中运出，这对于癌症细胞代谢至关重要。先前针对癌症细胞Warburg效应的策略是通过化学化合物抑制MCT1[57-60]。由于乳酸很小，因此并不明显可以将有毒分子标记到通过MCT1的分子上。

我们的进一步研究表明，18β-GA依赖于MCT1被运输到癌细胞中，MCT1的高表达使细胞对18β-GA更敏感，从而表明像18β-GA这样比乳酸大得多的分子可以通过MCT1运输，因而可利用Warburg效应靶向癌细胞，为癌症治疗提供了新的策略。

2.    材料与方法

2.1    细胞培养试剂和抗体

H1975和A375细胞系由北京大学的魏文胜博士赠予。A375细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。H1975细胞在Roswell Park纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养。所有细胞均补充10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素，在37°C、5%CO₂的湿润培养箱中培养。

DMEM、RPMI 1640、胰蛋白酶和FBS购自Life Technologies/Gibco Laboratories（纽约州格兰德岛，美国）。Lipofectamine 3000（Invitrogen）。18β-GA和AZD3965购自MedChemExpress（MCE）（中国上海），溶于DMSO。

2.2    细胞活性测定

将细胞以10⁴个/孔的密度接种在96孔板中过夜，然后用18β-GA在特定浓度下处理24或48小时（h）。处理后，使用CellTiter-Glo（Promega）、CCK-8（Abcam）和LDH细胞毒性检测试剂盒（Beyotime）测量每种浓度的细胞死亡百分比，与DMSO处理的细胞相比。

2.3    慢病毒包装质粒文库和感染

对于慢病毒生产，转染前一天将HEK293T细胞在五个10厘米培养皿中以大约40%的密度铺板。在转染当天，将含有12 μg质粒DNA（4 μg质粒文库：4 μg psPAX2：4 μg pMD2.G）的混合物准备在500 μL预温的Opti-MEM培养基中。然后将该混合物与Lipofectamine 3000在额外的500 μL Opti-MEM培养基中混合。在室温下孵育30分钟后，将转染混合物逐滴加入HEK293T细胞中。转染后48小时收获病毒上清液，通过0.45 μm Acrodisc注射器过滤器过滤，分装，并在-80°C下储存以供后续使用。为了确定感染复数（MOI），将目标细胞以5×10⁶个/孔的密度接种在六孔板中，并用不同体积的病毒上清液补充8 μg/ml聚布雷纳（Millipore，#TR-1003-G）在新鲜培养基中感染24小时。随后，将感染的细胞转移到15厘米培养皿中，并用2 μg/mL的嘌呤霉素进行选择。

2.4    全基因组CRISPR/Cas9筛选

全基因组CRISPR-Cas9筛选所用的慢病毒gRNA质粒文库由北京大学的魏文胜博士赠予。总共4×10⁷个细胞（MOI = 3）被接种在10厘米培养皿中用于sgRNA文库构建。细胞用文库感染，并在感染后用2μg/mL的嘌呤霉素处理72小时。整合了sgRNA-iBAR的细胞在额外培养15天以最大化基因敲除。细胞被重新接种到10厘米培养皿中，用18β-GA（130 μM）处理48小时，然后通过反复吹吸操作去除松散附着的圆形细胞。对于每轮筛选，细胞在新鲜培养基中培养，不加18β-GA，直到达到约50-60%的汇合度。所有耐药细胞被汇集并接受下一轮18β-GA筛选。在接下来的两轮筛选中，18β-GA的浓度分别为140 μM和150 μM。经过三轮处理后，收集耐药细胞和未处理细胞以提取基因组DNA（QIAGEN，69506），通过PCR扩增sgRNA（KAPA，KK2625），并进行下一代测序（NGS）。

为了处理来自筛选的NGS数据，我们采用了MAGeCK-iBAR算法，以评估对照组和实验组之间sgRNA水平的变化。利用MAGeCK-iBAR的标准设置，我们确定了每个基因的稳健秩聚合（RRA）分数和p值，同时考虑了结果的统计显著性和在三个iBARs中的可重复性。

2.5    候选基因验证

为了验证每个基因，我们选择了文库中设计的两个sgRNA，并将它们克隆到带有嘌呤霉素选择标记的慢病毒载体中。我们将sgRNA质粒与两个慢病毒包装质粒（psPAX2和pMD2.G）共转染到HEK293T细胞中。稳定表达Cas9的H1975细胞被慢病毒感染3天，并用2 μg/mL嘌呤霉素处理2天。将10⁴个细胞接种在96孔板中，并为每组设置三个重复孔。24小时后，实验组用18β-GA处理，对照组用DMSO处理24-48小时。按照标准方法进行CCK-8染色和检测。以对照孔为基准，对用18β-GA处理的实验孔进行标准化。

2.6    实时定量PCR 

将培养的细胞用Trizol处理。使用Direct-zol RNA试剂盒（Zymo，R2069）提取RNA，并使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒（Vazyme，R21101）合成cDNA。实时PCR使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，R211-01）在LightCycler96 qPCR系统（Roche）上进行。使用2^(-ΔΔCT)方法计算相对mRNA水平。以肌动蛋白作为内部对照。所有用于实时qPCR的引物均列于支持信息中的表S2。

2.7    免疫荧光

将细胞接种在聚赖氨酸包被的玻璃底皿中24小时。细胞附着到底部后，用4%PFA替换旧培养基并固定10分钟，在室温下用磷酸盐缓冲液Triton（PBST，含0.2%Triton X-100，体积/体积）洗涤三次，每次5分钟，用PB缓冲液（含2%Triton X-100、10%正常山羊血清，体积/体积）封闭30分钟。细胞与抗体稀释缓冲液（含0.25%Triton X-100、1%正常山羊血清，体积/体积）中的一抗孵育12小时来检测MCT1的表达，然后用洗涤缓冲液（含1%Triton X-100、体积/体积、3%NaCl，g/mL）洗涤三次，每次10分钟。细胞在黑暗中用稀释缓冲液中的二级抗体孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次，每次10分钟。最后，使用Zeiss LSM880共聚焦显微镜对细胞进行成像。

使用兔抗MCT1抗体（1:500稀释；Santa Cruz，目录号sc-365501），二抗为Alexa Fluor488抗兔免疫球蛋白G（1:2000稀释；Life Technology，目录号A11034）。

2.8    相关性分析

将17个细胞系（H1299、H2452、U2OS、TCCSUP、UM-UC-3、H1975、RKO、PC-3、HCT-15、TE-1、DU-145、COLO-680N、H226、HCT-116、H522、A375和MSTO-211H）用18β-GA（0-200μM）处理。48小时后，通过CCK-8测定法测定细胞活性，并使用非线性回归模型从所得剂量-反应曲线中插值计算EC₅₀值。通过qPCR检测SLC16A1mRNA水平。从CCLE[62]获得所有17个细胞系的基因表达分析实验的转录组范围的标准化mRNA水平。然后将每个基因在所有17个样本中的mRNA表达模式与EC₅₀值进行相关性分析。

2.9    液相色谱-串联质谱法测定

实验前一天将细胞在六孔板中铺板（每孔8×10⁵个细胞）。细胞用18β-GA处理最长8小时，在37°C下，然后用预冷PBS洗涤三次，并在100-1000μL的80%冰冷甲醇中裂解。在4°C下以16,000g离心10分钟后，将上清液用氮气蒸发器干燥，并在1 mL 50%乙腈中重新溶解。将浓缩样品通过LC-MS/MS（ThermoFisher Vanquish HPLC连接到ThermoFisher TSQ Altis三重四极杆质谱仪）进行分析。LC-MS检测和分析由CIBR质谱中心设施完成。

色谱分离使用ThermoFisher Vanquish HPLC、1.9μm、2.1×100mm分析柱进行。将色谱柱保持在40°C，并注入5μL样品。流动相A为5 mM醋酸铵（pH=7），流动相B为乙腈。对于18β-GA的分析，通过在7分钟内将流动相B从5%增加到95%来应用梯度洗脱；总分析时间为12分钟，流速设置为0.3 mL min-1。在负电喷雾离子化模式下检测化合物。多反应监测转换为469→425.3。确定了六点校准曲线，以便进行定量分析。

2.10    统计学

所有统计分析均使用Prism 5（GraphPad Software）进行。Mann-Whitney检验用于比较两列数据。单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey多重比较事后检验用于比较多列数据。统计显著性用星号表示：*=p<0.05，**=p<0.01，***=p<0.001，****=p<0.0001。

4.    结果

4.1    基于CRISPR的全基因组筛选寻找18β-GA敏感性所需的基因

我们研究了18β-GA对人非小细胞肺癌细胞H1975的毒性活性。18β-GA降低了H1975细胞的活性，半最大有效浓度（EC₅₀）为112.3 μM，与之前在其他细胞系中的观察结果一致[14]。通过测量细胞外乳酸脱氢酶（LDH）和细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平，我们发现18β-GA以剂量依赖性（图1A-C）和时间依赖性方式（图1D-F）诱导H1975细胞死亡。

图1. 全基因组CRISPR筛选18β-GA敏感性相关基因。（A-C）18β-GA对H1975细胞的剂量依赖性效应（48小时处理后）：细胞活力（A）、ATP水平（B）及乳酸脱氢酶活性（C），以DMSO作为对照。(D-F) 160 μM 18β-GA对H1975细胞作用的时间依赖性。(G) H1975细胞中18β-GA敏感性相关基因的CRISPR筛选示意图。（H）筛选所得全部基因的稳健秩聚合(RRA)评分。（I）筛选获得的基因命中结果。前两位命中基因分别为SLC16A1和BSG。列出了基于RRA评分的排序、RRA评分值以及筛选中富集的sgRNA数量。数据以均值±标准差（SD）表示，图A-F中n=3。

为了寻找参与18β-GA诱导的癌细胞死亡的基因，我们利用CRISPR/Cas9高通量筛选进行全基因组选择，寻找与18β-GA诱导的细胞死亡相关的靶点[26-30]。人类全基因组小导向核糖核酸（sgRNA）文库覆盖了19,114个基因，总共233,000个sgRNAs[61]。该sgRNA文库构建了三个内部条形码（iBARs），使得即使在高感染复数（MOI）下也能确保高质量筛选，同时显著减少了筛选过程所需的细胞数量。我们将这个CRISPR sgRNA文库稳定感染到稳定表达Cas9的H1975细胞系中。在构建细胞文库后，将其均匀分成两组。一组作为实验组，用18β-GA处理以富集对18β-GA耐药的细胞。另一组作为对照组，用等浓度的DMSO处理。经过三轮药物处理后，我们从实验组的富集细胞和对照组细胞中提取基因组DNA。通过PCR扩增sgRNA区域并进行二代测序（图1G）。

通过比较实验组与对照组细胞中sgRNA的分布情况，计算sgRNA丰度的差异。通过整合三轮药物处理的结果，使用MAGeCK-iBAR算法确定实验组中富集的sgRNA对应的基因[61]。筛选结果显示，排名前两位的基因是SLC16A1和BSG（图1H和S1）。这两个基因的RRA得分和FDR值高度显著（图1I）。SLC16A1基因编码MCT1，这是一种质子偶联的单羧酸转运蛋白，负责将乳酸和丙酮酸等单羧酸跨细胞膜转运[37-41]。BSG基因编码basigin，这是一种分子伴侣，对将MCT1护送到质膜至关重要[46,47]。

4.2    SLC16A1和BSG在18β-GA敏感性中的验证

为了验证这两个基因的作用，我们为每个基因选择了两个sgRNA（表S1）。

图2. 筛选获得候选基因的验证。（A）通过qPCR检测WT和SLC16A1^-/-H1975细胞中SLC16A1mRNA水平。采用双尾非配对Student's t检验（****P < 0.001）。（B和C）SLC16A1敲除对18β-GA诱导细胞死亡的影响。显示WT和SLC16A1^-/- H1975细胞经不同浓度18β-GA处理24小时后的细胞活力（B），以及经160 μM浓度处理不同时长的细胞活力（C）。(D) WT与/BSG^-/-H1975细胞中检测到的BSGmRNA水平。（E和F）BSG敲除对18β-GA诱导细胞死亡的影响。在与（B）和（C）相同条件下经18β-GA处理后，WT与BSG^-/-H1975细胞的存活率如图所示。（G和H）MCT1抑制剂对18β-GA诱导细胞死亡的影响。在相同条件下，H1975细胞在无或有MCT1抑制剂AZD3965（10 nM）存在下经18β-GA处理后的细胞活力。数据以均值±标准差表示，所有图示均n=3。

我们分离了两个H1975细胞克隆，其中SLC16A1和BSGmRNA被靶向敲除并通过qPCR验证（图2，A和D）。敲除SLC16A1不会改变BSG表达，反之亦然（图S2）。与筛选结果一致，对照细胞的活性随着18β-GA浓度的增加而降低，而缺乏SLC16A1的细胞在相同条件下的活性显著增加（图2B）。细胞活性也随着固定浓度的18β-GA在不同时间点的处理而降低，这种效应通过遗传靶向SLC16A1显著逆转（图2C）。通过浓度依赖性（图2E）或时间依赖性（图2F）测定发现，遗传靶向BSG也降低了H1975癌细胞对18β-GA的敏感性。我们还使用了MCT1特异性化学抑制剂AZD3965[65-72]。通过AZD3965处理后，18β-GA诱导的H1975细胞死亡显著减少（图2G和H）。总之，遗传和药理学结果证实了基于CRISPR的筛选结果，并证明SLC16A1和BSG对于18β-GA诱导的细胞死亡是必需的。

4.3 MCT1在18β-GA细胞摄取中的必要性

我们研究了MCT1在18β-GA诱导的细胞死亡中的作用机制。先前的研究表明MCT1能够促进药物转运[73,74]，这促使我们探究MCT1是否也能够促进18β-GA的细胞摄取。

图3. MCT1在18β-GA转运进入细胞过程中的必要性。（A）经140 µM 18β-GA孵育后，野生型（WT）、SLC16A1^-/-, SLC16A1^-/-+SLC16A1H1975细胞内18β-GA水平随时间变化的质谱测定结果。各组相对摄取量均以WT H1975细胞（经140 µM 18β-GA处理4小时）为基准进行归一化。（B）WT、SLC16A1^-/-及SLC16A1^-/-+ SLC16A1H1975细胞经18β-GA孵育4小时后的剂量曲线。（C）MCT1抑制剂降低WT H1975细胞的18β-GA摄取。在无或有10 nM AZD3965存在下测得的细胞内18β-GA水平剂量曲线。（D）WT A375或H1975细胞与SLC16A1^-/-A375或H1975细胞中18β-GA摄取量。采用双尾非配对Student's t检验（****P < 0.0001, ***P < 0.001）。（E）SLC16A1乳酸结合位点突变对18β-GA转运活性的影响。SLC16A1^-/-H1975细胞及重新表达野生型SLC16A1、SLC16A1R313Q、SLC16A1R313A或SLC16A1D309N的H1975细胞在4小时18β-GA孵育后时18β-GA摄取情况。（F）SLC16A1乳酸结合位点突变对18β-GA敏感性的影响。突变细胞系经18β-GA处理24小时后的细胞活力。所有图示数据均以均值±标准差表示，n=3。

我们将野生型（WT）和敲除型H1975细胞与18β-GA孵育，然后反复洗涤细胞以去除吸附在细胞表面的18β-GA，并通过质谱法测定细胞内18β-GA含量。H1975 WT细胞的细胞内18β-GA水平随时间增加（图3A）。在孵育18β-GA 4小时后，它也以浓度依赖性方式增加（图3B）。通过遗传靶向SLC16A1的H1975细胞显著降低了细胞内的18β-GA含量，这在时间（图3A）和剂量依赖性曲线（图3B）中都得到了支持。这一结果在另一个细胞系（A375黑色素瘤细胞；图3D）中也得到了进一步证实。为了确认SLC16A1^-/-突变克隆的表型确实是由缺乏SLC16A1基因引起的，我们将外源SLC16A1引入SLC16A1^-/-细胞（通过qPCR确认；图S3A）。我们发现外源回补SLC16A1可以挽救H1975细胞的18β-GA摄取表型，如时间（图3A）和剂量依赖性曲线（图3B）所示。因此，MCT1对于18β-GA的细胞摄取是必要且充分的。

这进一步通过检测MCT1特异性抑制剂AZD3965是否能够影响18β-GA的转运得到了证实。我们的结果显示，AZD3965显著降低了细胞内的18β-GA含量，其抑制水平与在敲除细胞系中观察到的水平接近（图3C）。因此，遗传学和药理学都支持MCT1是18β-GA转运所必需的。

据报道，MCT1的氨基酸残基精氨酸在第313位（R313）和天冬氨酸在309位（D309）参与了其与乳酸的结合，相同的突变已被证明可以消除乳酸转运[71]。因此，我们将这些先前验证的突变（R313A/Q、D309N）引入MCT1，并在SLC16A1^-/-细胞中表达。qPCR结果证实了MCT1的表达（图S3B）。具有R313Q、R313A或D309N突变的MCT1蛋白无法转运18β-GA（图3E）。表达这些突变体的H1975细胞无法恢复SLC16A1^-/-细胞对18β-GA的敏感性。

4.4    其他MCTs在18β-GA细胞摄取和细胞死亡诱导方面未取得成功

MCT1属于SLC16家族，在14个MCTs中，MCT1-MCT4介导单羧酸的质子偶联流入或流出，运输方向由质子和单羧酸根浓度梯度决定[33,34,36,75]。由于它们的底物特异性不同，我们研究了MCT2、3或4是否能够像MCT1一样转运18β-GA。

图4. MCT 2-4表达未能恢复18β-GA细胞摄取与敏感性。（A）SLC16亚家族的系统发育树。通过ClustalW比对并采用“邻接法”构建系统发育树。（B）SLC16家族对18β-GA的转运活性。在SLC16A1^-/-H1975细胞中重新表达SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7及SLC16A8-mCherry后，经18β-GA孵育4小时测得的摄取量。（C）表达不同SLC16家族成员的细胞经18β-GA处理后的细胞活力。（D）在SLC16A1^-/-H1975细胞中表达的SLC16家族成员的膜定位。比例尺，30 μm。所有图示数据均以均值±标准差表示，n=3。

我们将MCT2（SLC16A7）、3（SLC16A8）或4（SLC16A3）分别引入缺乏MCT1（SLC16A1^-/-）的H1975克隆中，qPCR结果证实了它们的表达（图S4）。我们进一步证实MCT2、3和4蛋白位于质膜上（图4D）。在用18β-GA孵育H1975细胞后，我们评估了细胞活性和细胞内18β-GA的摄取。只有外源MCT1，而不是MCT2、3或4，能够恢复缺乏内源MCT1的H1975细胞的18β-GA摄取（图4B）。同样，只有通过表达外源MCT1，而不是MCT2、3或4，才能恢复18β-GA诱导的细胞死亡（图4C）。因此，MCT1是18β-GA摄取和细胞死亡诱导所必需的。

4.5 BSG作为MCT1的辅因子，对于18β-GA转运和功能是必需的

BSG和Embigin（EMB）是两个先前报道的分子伴侣，它们协助MCT1-4向质膜的转位[36,47,73,76,77]。

图5. BSG特异性促进MCT1膜定位以实现18β-GA摄取和细胞毒性作用。（A和B）免疫荧光结果显示野生型和BSG^-/-A375细胞中MCT1的亚细胞定位。（C-F）BSG^-/-A375细胞中表达EMB/BSG-P2A-BFP后MCT1的亚细胞定位。BFP指示所示基因的表达。比例尺，30 μm。（G）WT、BSG^-/-、BSG^-/-+BSG、BSG^-/-+EMBA375细胞中18β-GA摄取情况。（H）WT、BSG^-/-、BSG^-/-+BSG、BSG^-/-+EMBA375细胞经18β-GA处理后的细胞活力。数据以均值±标准差表示，所有图示n=3。

为了检查BSG在MCT1膜定位中的参与以及其对18β-GA对细胞活性的影响，我们在黑色素瘤细胞A375中进行了BSG敲除，并使用抗MCT1抗体评估WT和BSG^-/-A375细胞中MCT1的亚细胞定位。MCT1定位于WT A375细胞的细胞膜上（图5A），但在BSG^-/- A375细胞的细胞膜上没有定位（图5B和图S5C）。BSG^-/-细胞的18β-GA摄取减少（图5G），并且18β-GA处理引起的细胞死亡在BSG^-/-细胞中增强（图5H）。

然后，我们将BSG和EMB引入BSG^-/-细胞系，qPCR结果证实了它们的表达（图S5，A和B）。只有BSG表达恢复了MCT1膜定位的表型（图5C），而EMB没有（图5D）。我们还评估了这些细胞中的18β-GA转运和敏感性。在BSG^-/-细胞中表达外源BSG显示出显著增加的18β-GA转运活性，几乎达到WT水平（图5G），并且对18β-GA的细胞死亡反应显著增加（图5H）。在BSG^-/-细胞中表达外源EMB没有恢复18β-GA的细胞摄取（图5G）或对18β-GA的细胞死亡反应（图5H）。

因此，BSG而不是EMB是MCT1定位于质膜的关键辅因子，这对于18β-GA的转运和细胞死亡至关重要。

4.6    SLC16A1表达、癌症预后和18β-GA敏感性

为了检查SLC16A1表达是否与患者预后相关，我们分析了SLC16A1表达水平与TCGA所有病例的患者预后总生存（OS）之间的相关性（图6A）。在个别肿瘤类型中，高SLC16A1表达与低级别胶质瘤（LGG）（logrank p=6.20E-07，HR=5.5，p（HR）=8.80E-06）（图6B）、肺腺癌（LUAD）（logrank p=0.00022，HR=2.3，p（HR）=0.00031）（图6C）、软组织肉瘤（SARC）（logrank p=0.0033，HR=2.7，p（HR）=0.0047）（图6D）和胰腺腺癌（PAAD）（logrank p=0.0016，HR=2.8，p（HR）=0.0023）（图6E）的不良总生存期独立显著相关。虽然这些结果支持SLC16A1作为预后诊断中的一个分子标志物，但我们的上述发现表明，MCT1在18β-GA敏感性中的新可能性，为开发靶向MCT1进入和杀死癌细胞的药物（如18β-GA）提供了新的机会。

图6. MCT1高表达与肺腺癌患者生存率较低及18β-GA敏感性较高呈正相关。（A）基于GEPIA平台，对TCGA泛癌队列中SLC16A1表达水平（低表达组<20%；高表达组＞80%）进行的总生存期（OS）Kaplan-Meier分析。采用Log-rank检验（Mantel-Cox检验）比较组间总生存期（OS）。Cox比例风险回归分析得出风险比及P值。数据源自癌症基因组图谱（TCGA）。（B）SLC16A1对生存具有显著影响的肿瘤类型Kaplan-Meier生存分析（低表达组<20%；高表达组＞80%）。LGG，低级别脑胶质瘤；LUAD，肺腺癌；SARC，肉瘤；PAAD，胰腺腺癌。P值源自Log-rank检验。（C）四种肺癌细胞系经18β-GA指定浓度处理48小时后的细胞活力。（D）基于（C）图计算的EC₅₀值。（E）通过qPCR测定的SLC16A1mRNA水平。（F）SLC16A1表达水平与细胞对18β-GA敏感性（EC₅₀）的相关性。所有数据均以均值±标准差表示，n=3。

LUAD是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一（约占肺癌病例的45%）[78]，其五年生存率不到20%[79]。我们使用四种人肺癌细胞系（H226、H1299、H522和H1975）来评估18β-GA的治疗潜力。在0-200μM的浓度范围内评估剂量依赖性细胞反应（图6F）。使用非线性回归分析（四参数逻辑模型）计算半最大有效浓度（EC₅₀）（图6G）。通过定量实时PCR测定SLC16A1mRNA表达水平（图6H），用于与18β-GA敏感性的相关性分析。

结果显示SLC16A1表达与18β-GA耐药性之间存在显著的负相关（图6I）：高表达SLC16A1的肺癌细胞系（H522和H226）对18β-GA的敏感性大于低表达系（H1299：EC₅₀ = 171.8μM；p<0.01，Pearson's r² = 0.9678）。

因此，除了预期的MCT1允许更好的癌细胞存活和更差的患者存活外，我们关于MCT1参与18β-GA敏感性的发现提示，MCT1可作为基于18β-GA的癌症治疗的一个生物标志物。

4.7    SLC16A1表达作为预测癌症细胞对18β-GA敏感性的主要决定因素

为了研究SLC16A1作为预测生物标志物的相关性，除了LUAD外，我们将分析扩展到涵盖八种癌症类型（前列腺、结肠、食管、肺、膀胱、黑色素瘤、胸膜间皮瘤、骨肉瘤）的17个细胞系。尽管它们的来源多样，但它们显示出SLC16A1mRNA水平与18β-GA敏感性之间稳健的负相关（Pearson's r = -0.8006，p = 0.0002；图7A-I和图S6）。

图7. MCT1表达作为决定癌细胞对18β-GA敏感性的主要因素。（A）基于图S6及（E-H）所示剂量反应曲线计算的癌细胞18β-GA处理EC₅₀值。（B）（A）图中EC₅₀值的提琴图。（C）通过qPCR测定的癌细胞中SLC16A1表达水平。（D）（C）图中SLC16A1表达水平的提琴图。（E-H）UM-UC-3、TE-1、MSTO-211H、H2452细胞经18β-GA处理48小时后的存活率。其他细胞系数据见图S6。(I) SLC16A1表达水平与细胞对18β-GA EC₅₀敏感性的相关性。（J）CCLE数据库中EC₅₀值与基因表达水平的皮尔逊相关系数。SLC16家族转运蛋白基因标注，SLC16A1以红点表示。所有图示数据均以均值±标准差表示，n=3。

由于人类基因组中还有其他MCTs，我们对这些细胞系在癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库[62]中的全基因表达水平进行了无偏分析，并与EC₅₀进行了相关性分析。我们的结果显示，在20,000个基因中，SLC16A1mRNA水平与细胞对18β-GA敏感性的EC₅₀具有最高的相关性（图7J）。相比之下，其他MCTs的表达水平与18β-GA敏感性的EC₅₀没有显著相关性（图7J和图S7）。

这些结果表明，SLC16A1基因表达水平是18β-GA敏感性的最佳遗传预测因子，表明虽然Warburg效应需要更高的乳酸转运来维持癌细胞存活，并且高MCT1预测预后不良，但高MCT1也可以被像18β-GA这样的药物靶向，这些药物通过进入癌细胞并杀死它们。

5.    讨论

我们进行了一项全基因组CRISPR筛选，以鉴定18β-GA敏感性所需的基因，18β-GA是一种来自具有抗癌活性的中药的分子。我们发现乳酸转运蛋白MCT1及其膜分子伴侣BSG是18β-GA敏感性的主要决定因素。MCT1在18β-GA的细胞摄取中起着关键作用，而BSG对于MCT1定位于质膜是必需的。SLC16A1mRNA水平预测人类癌细胞对18β-GA的敏感性。我们的研究表明SLC16A1介导的18β-GA转运与对癌细胞的毒性效应之间存在直接联系。

我们对TCGA数据的分析揭示了高SLC16A1表达与多种癌症类型不良预后之间的显著相关性，考虑到最近对基于肿瘤分子特征的个性化医疗策略的关注，这一发现具有重要意义的。这种相关性可以被颠倒过来，如果像18β-GA这样的药物被用来通过MCT1进入癌细胞。我们对癌细胞系的实验支持这一建议，并进一步证实了SLC16A1在18β-GA转运中的作用。SLC16A1表达水平与CCLE数据库中细胞系的18β-GA EC₅₀值之间的相关性进一步证实了SLC16A1作为18β-GA敏感性的重要预测因子。然而，在体外实验条件下，18β-GA需要高浓度才能杀死肿瘤细胞。因此，18β-GA的分子结构应该被修改，以降低杀死细胞所需的浓度并增加效力；同时，保留通过SLC16A1运输的能力，这可以对高表达SLC16A1的肿瘤产生治疗效果。这样的化合物有望成为针对具有Warburg效应的肿瘤的新药物。

MCT1一直是癌症治疗的已知靶点，但它一直是通过小分子抑制剂来靶向的[65-72]，这些抑制剂抑制癌细胞中乳酸的排出，导致细胞死亡。18β-GA不同之处在于，它利用MCT1进入细胞，然后发挥毒性效应。

通过转运蛋白的药物是已知的，但它们并不具有癌症特异性。SLC在化学分子的细胞摄取中很重要。例如，核苷转运蛋白SLC29A1与核苷类似物药物（如克拉法滨、吉西他滨和氟尿嘧啶）的运输有关[80]。叶酸转运蛋白SLC19A1运输甲氨蝶呤和培美曲塞[81,82]，有机阳离子转运蛋白SLC22A1（OCT1）已报道与二甲双胍运输有关[83,84]。美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局目前倡导在临床药物相互作用研究中测试ABC和SLC22/SLCO家族成员[85]。对394个人类SLC基因和60种细胞毒性药物的CRISPR-Cas9敲除文库进行筛选，发现大量SLC-化合物关联，包括SLC11A2/SLC16A1与青蒿素衍生物的关联，以及SLC35A2/SLC38A5与顺铂的关联[96]。这种方法也可能导致发现更多来自天然产物的小分子，例如从草药中提取的化合物，用于潜在的治疗用途。

由于18β-GA的毒性并不高，一个可行的策略是开发衍生物，以增强其杀伤癌细胞的效力，但保留其通过MCT1进入细胞的特性——其底物口袋可能通过与用于乳酸结合相同的精氨酸313和天冬氨酸309残基识别18β-GA的单羧酸。药物应该从18β-GA中修改，通过MCT1进入癌细胞，但比18β-GA更具毒性。药物也可以在结构上与18β-GA不同，但使用相同的机制：通过MCT1进入癌细胞并引起细胞死亡。

作者贡献声明

夏冰心：概念化、数据整理、正式分析、调查、方法论、项目管理、资源、软件、监督、验证、可视化、撰写——原创。

朱晨：方法论、撰写——审阅与编辑。

饶毅：概念化、撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明与本文内容无利益冲突。

致谢

我们感谢北京大学的魏文胜博士提供CRISPR文库质粒和表达Cas9的细胞系。我们感谢北京生命科学研究所的张二荃博士和徐国泰博士，以及北京大学的杜鹏、蒋争凡和曾泽贤博士，他们慷慨地提供了癌细胞系。我们感谢CIBR的生物质谱中心以及孙祥丽女士和于晓倩女士在LC-MS方面的协助。

附录    A.

补充数据本文的补充数据可在在线版本中找到。https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2026.153492

数据可用性

本文报告的原始序列数据已存入中国国家基因数据中心[63]的基因组序列档案库[64]（GSA-Human：HRA014110），可在以下网址公开访问：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human

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附图

附图S1. CRISPR/Cas9文库筛选结果（按排序列出前50个基因），与图1相关。

附图S2. SLC16A1基因敲除不影响BSG表达，反之亦然（与图2相关）。（A）通过qPCR测定野生型和BSG^-/-H1975细胞中SLC16A1的表达水平。（B）通过qPCR测定野生型和SLC16A1^-/-H1975细胞中BSG的表达水平。

附图S3.野生型（WT）、SLC16A1^-/-、SLC16A1^-/-+SLC16A1及点突变细胞系中SLC16A1的表达水平，与图3相关。（A）通过qPCR测定WT、SLC16A1^-/-, SLC16A1^-/-+SLC16A1H1975细胞中SLC16A1的表达水平。采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验（**P < 0.01；****P < 0.0001）。（B）通过qPCR测定SLC16A1^-/-, SLC16A1^-/-H1975细胞中重新表达SLC16A1WT、SLC16A1R313Q、SLC16A1R313A和SLC16A1D309N的表达水平。数据以均值±标准差表示，所有图示均n=3。

附图S4. 表达SLC16家族成员的细胞中SLC16基因的表达情况。（A-D）通过qPCR测定SLC16A1^-/-, H1975/SLC16A1^-/-重新表达SLC16A1、SLC16A3、SLC16A7、SLC16A8的H1975细胞中上述基因的表达水平。采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验（****P < 0.0001）。数据以均值±标准差表示，所有组别n=3。

附图S5. 表达MCT辅因子细胞中的辅因子及SLC16A1表达水平。（A-C）通过qPCR测定野生型、BSG^-/-、BSG^-/-+BSG、BSG^-/-+EMBA375细胞中BSG、EMB、SLC16A1的表达水平。采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验（****P < 0.0001, ***P < 0.001, n.s. P > 0.05）。数据以均值±标准差表示，所有组别n=3。

附图S6. 癌细胞系对18β-GA的敏感性。17种癌细胞经18β-GA处理48小时后的细胞活力。数据以均值±标准差表示，所有图示均n=3。

图S7. MCT转运蛋白与分子伴侣表达水平与18β-GA敏感性的相关性。EC₅₀值与CCLE数据库中转录组mRNA表达数据的皮尔逊相关系数。各细胞系中SLC16家族转运蛋白及对应分子伴侣相对表达水平（纵轴）与EC₅₀值（横轴）的散点图。

表格

表S1. 用于建立细胞系的sgRNA。

表S2. 实时荧光定量PCR引物。