七重跨膜受体论文2：胆汁酸激活GPR39的分子信号传导
机器翻译全文约 40 分钟【我实验室最近费了好几年时间，专门攻GPCR的配体。GPCR/七重跨膜蛋白是体内很重要而且很多的受体分子。鼻子之外有三百多个，其中一百多个是全世界约35%药物的靶点，所以不仅有基础意义，还有很大应用潜力。
我实验室的研究生自振滔在2024年初发表一篇论文，证明胆汁酸是GPR39的内源配体，一方面发现了GPR39的内源配体，一方面提出了急性胰腺炎的一个分子机理：认为胆汁酸刺激胰腺的GPR39受体而导致细胞死亡。在小鼠模型，也验证了这一假说。如果在人也是这样的机理，那么就是提出了人类常见病急性胰腺炎的分子机理。而这一机理立即就意味着设计GPR39的拮抗剂就是治疗急性胰腺炎的有效方法。
后来，研究生黄燕云是加入GPR39这一课题。她研究GPR39受体下游的信号。她用了多个方法，系统地研究了胆汁酸激活GPR39的信号转导。而夏晨亮用电生理方法帮助验证了其中一部分下游。
这样的课题，系统地用生物物理的电生理和光学成像方法、生物化学的方法，对研究生是很好的分子生物学和细胞生物学培养】
黄燕云,自振滔, 夏晨亮, 饶毅
摘要
胆汁酸（BAs）不仅长期被认为在食物乳化中发挥作用，同时还被认为具有生物信号功能。我们近期通过测量细胞内钙离子浓度发现：G蛋白偶联受体GPR39是3-O-硫酸化胆汁酸的受体，包括3-硫酸石胆酸（LCAS）、3-硫酸牛磺石胆酸（TLCAS）及3-硫酸甘油石胆酸（GLCAS）。在此，我们通过非洲爪蟾卵母细胞电生理记录、钙成像、NanoBiT、ONE-GO等多重检测手段，验证了胆汁酸对GPR39的激活作用。在30种胆汁酸中，仅硫酸化形式（LCAS、TLCAS和GLCAS）能激活GPR39，并激活Gαq、Gαi及Gα12/13亚家族中的9种不同Gα蛋白亚型。LCAS在胰腺和肝脏中可以引起ERK1/2磷酸化，该效应在Gpr39敲除小鼠中显著减弱。此外，我们通过点突变分析确定了GPR39信号传导的关键必需残基。综上，我们的研究揭示了胆汁酸激活GPR39下游的信号通路。
关键词
胆汁酸，G蛋白偶联受体，GPR39，信号转导，细胞外信号调节激酶（ERK）
引言
G蛋白偶联受体（GPCR）在生理过程中发挥重要作用，是药物靶点的主要家族（1），约占所有获批治疗药物的36%（2）。GPR39最初在胎儿脑组织中被鉴定为生长激素分泌素受体（GHSR）的同源物（3），属于A类GPCR（4）。GPR39的表达分布于胰腺、肝脏、脂肪组织、胃肠道及中枢神经系统（CNS）（5, 6）。此外，功能方面的研究表明GPR39主要参与调控细胞增殖、分化、存活、凋亡、离子转运及pH稳态（7-12）。
二十年前，GPR39被发现是锌离子（Zn2+）的受体（13,14）。然而，GPR39的内源性配体始终存在争议（15）。2024年，我们鉴定出胆汁酸（BAs）是GPR39的内源性配体，其中来自进化早期物种的GPR39仅响应胆汁酸，而来自进化后期物种的GPR39则同时响应胆汁酸和Zn2+（16）。我们先前的研究表明，胆汁酸（尤其是LCAS、GLCAS和TLCAS）可通过GPR39下游的Gαq通路激活细胞内Ca2+信号，且GPR39在HEK293T细胞及胰腺腺泡细胞中对胆汁酸诱导的Ca2+响应具有必要且充分的作用（16）。然而，Ca2+信号仅是GPCR功能的一个侧面，胆汁酸激活GPR39所引发的更广泛下游信号谱系仍未被充分阐明。在此，我们通过多种检测方法，包括经典的非洲爪蟾卵母细胞系统、基于NanoBiT的Gα和β-arrestin招募检测（17）、用于检测Gα活化的ONE-GO生物传感器（18），以及原代胰腺腺泡细胞和肝细胞中ERK磷酸化水平的测定验证了胆汁酸对GPR39的激活。我们还研究了GPR39蛋白中参与其活化的必需氨基酸残基。
结果
电生理记录证实胆汁酸可以激活非洲爪蟾卵母细胞中的GPR39
我们采用双电极电压钳技术（TEVC）对非洲爪蟾卵母细胞进行研究，该技术是检测GPCR激活的经典方法（19）。该技术能够检测由Gαq介导的内质网钙释放激活的内源性钙激活氯离子通道（CaCCs）（20）（图1A）。非洲爪蟾卵母细胞作为研究膜受体的经典模型，其可控且简化的环境有利于特异性评估配体-受体活性（21）。
图1. 非洲爪蟾卵母细胞中GPR39信号传导的验证
A,非洲爪蟾卵母细胞系统中GPCR介导的离子通道信号示意图。Gαq型GPCR激活内源性钙激活氯离子通道（CaCCs）。
B,注射编码绿色荧光蛋白（GFP）或GPR39的mRNA的卵母细胞代表性电流轨迹，经500 μM Zn2+处理并与10 μM Gαq抑制剂YM254890或100 μM CaCCs抑制剂Caccinh A01共培养。
C，GPR39表达卵母细胞经Zn2+处理后记录的代表性电流轨迹。
D，GPR39表达卵母细胞中Zn2+诱导电流的剂量反应曲线：曲线分别对应单独Zn2+处理，或Zn2+联合10 μM YM254890或100 μM Caccinh A01共培养。
E，在10 μM YM254890或100 μM Caccinh-A01存在下经500μM Zn2+处理后电流幅度的统计分析，数据以均值± 标准差（SD）表示（N ≥3）。数据采用单因素方差分析，****表示p<0.0001。Zn2+与YM254890及Caccinh-A01的对比的p值均< 0.0001。
为验证Zn2+激活GPR39受体的作用，我们将编码绿色荧光蛋白（GFP）的mRNA（图1B）或编码GPR39的mRNA（图1C）注入卵母细胞。仅在表达GPR39的卵母细胞中灌流Zn2+引发了内向电流（图1C），其半数有效浓度（EC₅₀）为114.8 μM（图1D）。即使Zn2+浓度高达500 μM，GFP组卵母细胞仍无反应（图1B）。Gαq抑制剂YM254890（图1B和D）（22）与CaCCs抑制剂Caccinh-A01（图1B和D）（23）均可阻断该电流。500 μM Zn2+激活的最大电流幅值为883 ± 38.5 nA，经10 μM YM254890抑制后降至4.65 ± 2.17 nA（p< 0.0001，图1E），经100 μM Caccinh-A01抑制后降低至25.3 ± 12.2 nA（p < 0.0001，图1E）。这些药理学结果表明非洲爪蟾卵母细胞是验证GPR39激活的可靠系统。
接下来，我们研究了LCAS对卵母细胞中GPR39的激活作用。LCAS 在表达GPR39的卵母细胞中诱发了剂量依赖性的内向电流（图2B），但即使在高达500 μM的LCAS浓度下，也未能在表达GFP的卵母细胞中诱发反应（图2A）。LCAS激活GPR39的EC50值为117 μM（图2C）。LCAS诱导的电流也可以被YM254890（图2A和C）及Caccinh-A01（图2A和C）抑制。500 μM LCAS诱导的最大电流幅值为838 ± 54.7 nA，经10 μM YM254890抑制后降至18.7 ± 13.7 nA（p< 0.0001，图2D），而100 μM Caccinh-A01则使其降至25.1 ± 14.5 nA（p< 0.0001，图2D）。这些结果进一步证实LCAS是GPR39的配体。
图2. 非洲爪蟾卵母细胞系统验证LCAS是GPR39配体
A、注射编码GFP或GPR39的mRNA的卵母细胞记录的代表性电流轨迹：轨迹对应500 μM LCAS处理，含/不含10 μM Gαq抑制剂YM254890或100 μM CaCCs抑制剂Caccinh-A01预处理。
B，GPR39表达卵母细胞经不同浓度LCAS（10 μM、50 μM、100 μM、250 μM、500 μM）刺激后记录的代表性电流轨迹。
C，GPR39表达的非洲爪蟾卵母细胞中LCAS诱导电流幅度的剂量反应曲线：曲线分别反映单独使用LCAS，或LCAS联合10 μM YM254890或100 μM Caccinh-A01的情况。
D，GPR39表达非洲爪蟾卵母细胞经500 μM LCAS处理（含/不含10 μM YM254890或100 μM Caccinh-A01）的电流幅值统计分析，数据以均值±标准差表示（N≥3）。采用单因素方差分析，**** 表示p< 0.0001。LCAS 与YM254890 及Caccinh-A01 的p值均< 0.0001。
E，外源性G蛋白门控内向整流钾通道（GIRK）在卵母细胞中的示意图。
F，共表达GIRK1S、GIRK3和GPR39的卵母细胞经LCAS刺激后记录的代表性电流轨迹，含/不含100 ng/ml PTX过夜预处理。
G，共表达GIRK1S、GIRK3和GPR39卵母细胞电流幅值的统计分析：各组对应LCAS刺激（含/不含100 ng/mL PTX预处理）。数据以均值± 标准差表示（N ≥ 3）。统计比较采用双尾t检验（*** p < 0.001）。LCAS组与PTX组的精确p值为0.0003。
此外，当Gβγ二聚体与Gαi解离后，外源表达的G蛋白门控内向整流钾通道（GIRKs）即可被激活（图2E）。为验证LCAS激活GPR39是否同样偶联至Gαi信号通路，我们向卵母细胞注射了GIRK两个亚基（GIRK1S和GIRK3）的mRNA，同时注入GPR39的mRNA。在高钾培养基中灌注250 μM LCAS可以诱发出显著的电流（图2F），该电流被百日咳毒素（PTX）——一种常见的Gαi抑制剂——所抑制。250 μM LCAS诱导的最大电流幅度为491.3 ± 42.8 nA，经100 ng/ml PTX处理后降至237.6 ± 30.7 nA（p< 0.001，图2G）。综上所述，这些结果表明Gαq和Gαi亚基位于LCAS激活的GPR39信号通路下游。
LCAS激活后GPR39对Gαq、Gαi及Gα12/13蛋白的招募作用
已知GPCR存在偏向性信号传导，即不同激动剂可激活同一GPCR下游的不同信号通路（24, 25），包括对Gα蛋白和β-arrestin的差异性招募（26, 27）。G蛋白异三聚体由α、β和γ亚基组成；Gα-GTP复合物与Gβγ二聚体均能调控下游效应器功能（28）。其中Gα蛋白可分为Gαq/11家族、Gαi/o家族、Gαs家族及Gα12/13家族。人类基因组编码16种Gα蛋白同工型、5种Gβ蛋白同工型及12种Gγ蛋白同工型（29）。
为了系统地研究GPR39激活的下游信号通路，我们首先采用NanoBiT检测技术检测了LCAS激活后Gαq、Gαi、Gαs及Gα12四个家族的招募情况（17）。
图3. LCAS激活后GPR39招募Gαq、Gαi和Gα12/13的机制
A.通过NanoBiT检测法测定的LCAS激活GPR39的剂量反应曲线，显示Gα蛋白的招募过程。数据以HBSS对照组为基准进行归一化处理。
B，LCAS激活GPR39对不同Gα蛋白招募效率的雷达图。各Gα蛋白的招募强度以响应效力对数值表示（log [RAi]）。
C，基于NanoBiT检测法测得的LCAS激活GPR39时不同Gα蛋白的最大效应值（Emax）。数据源自3次独立重复实验，每组3孔（250 μM浓度），N = 9，均值± 标准差。数据以HBSS对照组为基准进行归一化处理。采用单因素方差分析，**表示p< 0.01，****表示p < 0.0001。Gαi、Gα12和Gαs与Gαq相比的p值分别为0.0013、< 0.0001和< 0.0001。
D，基于NanoBiT检测的LCAS激活不同Gα蛋白的GPR39 EC50值。N = 3，均值± 标准差。采用单因素方差分析，ns表示p > 0.05。Gαi与Gαq、Gα12与Gαq的p值分别为0.7487和0.9834。
E，ONE-GO检测示意图，显示纳米荧光素（Nluc）与黄色荧光蛋白（YFP）之间能量共振转移机制，用于检测GPCR激活后Gα蛋白招募。
F，通过ONE-GO检测确定的LCAS经GPR39激活的Gα蛋白分类。
G，在表达GPR39及不同ONE-GO生物传感器的HEK293T细胞中，经LCAS刺激后的BRET信号。每种浓度均进行三次重复检测。N = 3，均值± 标准差。
H，基于ONE-GO检测法，不同Gα蛋白经LCAS激活时GPR39的Emax值。数据来自3次独立重复实验，N = 3，均值± 标准差。
I，基于ONE-GO检测，LCAS激活GPR39对不同Gα蛋白的EC50值。N = 3，均值± 标准差。
LCAS激活GPR39招募了Gαq、Gαi和Gα12蛋白，但未招募Gαs（图3A和S1）。Gαq展现出最高最大反应值（Emax = 1.58，图3C），而Gαi以58.0 ± 10.6 μM的EC50值显示最高效力，其次为Gαq（70.2 ± 10.4 μM）和Gα12（73.0 ± 17.2 μM）（图3D）。基于log (RAi) 的雷达图分析(30)证实GPR39与Gαi和Gαq存在较强的招募（图3B）。
为了深入解析GPR39的Gα蛋白信号传导机制，我们采用了ONE-GO生物传感器（图3E），该技术可检测10种Gα亚型（18）的激活状态（图3F）。我们发现LCAS激活的GPR39可激活多种Gα蛋白，包括Gαq、Gαi/o家族（Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαoA、GαoB、Gαz）及Gα12/13家族（Gα12和Gα13）（图3G）。
除G蛋白通路外，β-arrestin通路是GPCR激活后的另一主要下游通路（31, 32）。为检测β-arrestin-1和-2的招募，我们采用了NanoBiT方法（33）。我们观察到LCAS激活GPR39对β-arrestin-1和-2存在弱招募，其EC50值分别为125 μM和40.5 μM（图S2，A和B）。Zn2+单独作用时未诱导β-arrestin-1或-2招募至GPR39，但4 μM Zn2+的联合应用著增强了LCAS诱导的β-arrestin-1和-2招募（图S2，A和B）。
胆汁酸激活GPR39下游信号传导的比较研究
胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成（34），储存于胆囊，进入肠道后（35）经肠道细菌代谢生成次级胆汁酸（36）。为系统探究胆汁酸对GPR39介导的下游信号的影响，我们采用NanoBiT检测技术筛选了30种不同胆汁酸对Gα蛋白的招募情况（图4A）。
图4. 胆汁酸激活GPR39后的Gα蛋白招募
A，基于NanoBiT检测的胆汁酸激活GPR39后Gα蛋白招募热图。每种胆汁酸以200 μM浓度重复检测三次。数据以HBSS组为基准进行标准化。
B-D，基于NanoBiT检测的剂量反应曲线，显示LCAS、TLCAS和GLCAS对GPR39的激活及Gαq（B）、Gαi（C）和Gα12（D）蛋白的招募情况。N = 3，平均值± 标准差。数据以HBSS组为基准进行标准化。
E-N，在表达GPR39及ONE-GO生物传感器的HEK293T细胞中测得的BRET信号，Gαq（E）、Gαi1（F）、Gαi2（G）、Gαi3（H）、GαoA（I）、GαoB（J）、Gαz（K）、Gα12（L）、Gα13（M）以及Gαs（N）在LCAS、TLCAS和GLCAS刺激下的BRET信号。每种浓度均进行三次平行检测。N = 3，平均值± 标准差。
结果表明在三种硫酸化胆汁酸（LCAS、TLCAS和GLCAS）刺激下观察到Gαq、Gαi和Gα12向GPR39的招募（图4A）。这三种硫酸化胆汁酸在招募Gαq方面无显著差异（图4B）。对于Gαi，LCAS表现出最高效力（图4C）。三种硫酸化胆汁酸激活GPR39对Gα12的招募作用均较弱（图4D）。
进一步我们采用ONE-GO检测法评估三种硫酸化胆汁酸对Gα蛋白的激活作用。LCAS、TLCAS和GLCAS均可激活Gαq、Gαi/o（Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαoA、GαoB、Gαz）及Gα12/13（Gα12和Gα13）家族成员，但未能激活Gαs蛋白。这些结果与基于NanoBiT的G蛋白招募检测一致。因此，我们的结果系统地表明，在胆汁酸-GPR39信号传导中，硫酸化胆酸LCAS、TLCAS和GLCAS是GPR39的强效激动剂，并优先通过Gαq、Gαi和Gα12/13通路传递信号。
LCAS与Zn2+激活GPR39引发的差异性信号传导
为比较Zn2+与LCAS对G蛋白偶联的偏好性，我们采用了ONE-GO检测法分析了Zn2+诱导的GPR39信号传导。
图5. LCAS和Zn2+通过GPR39激活的信号传导通路
A-J，在表达GPR39及不同ONE-GO生物传感器的HEK293T细胞中测得的BRET信号：Gαq（A）、Gαi1（B）、Gαi2（C）、Gαi3（D）、GαoA（E）、GαoB（F）、Gαz（G）、Gα12（H）、Gα13（I）和Gαs（J）共同表达时，经LCAS和Zn2+刺激后的BRET信号。每种浓度均进行三次重复测定。N = 3，平均值± 标准差。
K，基于ONE-GO检测，不同Gα蛋白对LCAS和Zn2+激活GPR39的最大效应值（Emax）。N = 3，均值± 标准差。采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验，ns表示p > 0.05，*表示p < 0.05，***表示p < 0.001。LCAS与Zn2+作用下Gαi1、Gαi2及Gαi3的p值均< 0.0001。LCAS与Zn2+组间Gα12、Gα13和Gαs的p值均> 0.9999。LCAS与Zn2+组间Gαq、GαOA、GαOB和Gαz的p值分别为0.8991、0.9226、0.4728和0.3154。
L，基于ONE-GO检测法测定的不同Gα蛋白中，LCAS与Zn2+激活GPR39的EC50值。N = 3，均值± 标准差。采用双因素方差分析结合Tukey多重比较检验，ns表示p > 0.05，**表示p < 0.01，****表示p < 0.001。N = 3，均值± 标准差。LCAS与Zn2+对Gαi1、Gαi2和Gαi3的p值均< 0.0001。LCAS与Zn2+组间Gαq、GαOA、GαOB、Gαz、Gα12及Gα13的p值分别为0.0007、0.5059、0.1692、0.7625、0.9956和0.1881。
我们发现Zn2+激活了多种G蛋白，包括Gαq、Gαi/o（Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαoA、GαoB、Gαz）及Gα12/13家族成员（Gα12、Gα13），但不激活Gαs（图5A-J）。按最大响应强度排序，Zn2+处理后激活的GPR39下游Gα蛋白多数与LCAS激活GPR39的下游G蛋白相似（图5K）。然而，与Zn2+相比，LCAS诱导的三种Gαi同工型（Gαi1、Gαi2和Gαi3）的Emax明显更高（图5K）。值得注意的是，在所有Gα蛋白中，Zn2+的EC50值均低于LCAS（表明Zn²⁺效力更高）（图5L）。GPR39响应LCAS和Zn2+时激活Gα蛋白的详细信息详见表S1。
GPR39受体中参与胆汁酸和锌离子信号传导的必需氨基酸残基
为了寻找负责GPR39激活的关键残基，我们对不同物种的GPR39蛋白进行了多重序列比对（图6A），并构建了21个携带单点氨基酸残基突变的突变体及2个携带双氨基酸残基突变的突变体。
图6. GPR39中参与LCAS和Zn2+激活的氨基酸残基
A，小鼠GPR39的蛇形图。氨基酸残基根据其在物种间的保守性进行着色。黄色单字母氨基酸代码表示本研究中突变为丙氨酸的残基，数字代表残基位置。
B-G，GPR39突变体对LCAS和Zn2+激活的响应：(B) TM-1/2突变体（L33A, V82A, E90A, S93A），(C) TM-3突变体（F115A, E116A, S119A, Y120A, F113A），(D) TM-4突变体（V166A, L170A），(E) TM-5突变体（W217A, I224A/F225A, F228A），(F) TM-6突变体(L292A, W296A, N299A/Q300A,R302A, R303A, K309A)，(G) TM-7突变体（D330A, F333A, Y334A）。数据以野生型GPR39响应值为100%进行标准化。
H-I，GPR39突变体对LCAS和Zn2+响应的效力与EC50值。效能值以野生型GPR39响应为基准（100%）。N = 3，均值± 标准差。采用单因素方差分析，*表示统计学差异，p值详见表S2。
J，不同突变体中Zn2+诱导EC50变化倍数与LCAS诱导EC50变化倍数的散点图及线性拟合。
K，不同突变体中Zn2+诱导效能与LCAS诱导效能的散点图及线性拟合。
L-M，双点突变型GPR39（F115A/V166A、V166A/Y334A、F115A/Y334A）在LCAS与Zn2+诱导下的剂量反应曲线。数据以野生型GPR39响应值为基准归一化（100%）。N = 3，均值± 标准差。
通过钙离子成像技术（图6B-G）量化了这些突变体对LCAS和锌离子的响应。这25个残基在不同物种中高度保守（图S3A），且均位于A类受体的正位配体结合口袋内（37）。
这些保守残基的突变均削弱了GPR39对LCAS和Zn2+的Emax响应值。无论是LCAS（图6H上图）还是Zn2+（图6I上图），多数突变体相较野生型（WT）均表现为降低的Emax。为排除表达缺陷，我们通过ELISA检测了所有突变蛋白的细胞表面表达水平。除L170A、I224A/F225A、R303A及F115A/Y334A（突变后蛋白表达水平低于野生型70%）外，其余突变体均能有效定位于膜上（图S5D）。
其中，R302和E116残基的突变对GPR39的Emax产生了最显著的影响：R302A和E116A突变体对LCAS的Emax值降至野生型（WT）的三分之一以下（图6H上图），且两者均完全丧失对Zn2+的响应能力（图6I上图）。V166A和Y334A突变体显著提高了LCAS的EC50值（图6H下图），而W217A、F115A和K309A则提高了Zn2+的EC50值（图6I下图）。
如散点图所示，LCAS诱导的突变体Emax值与Zn2+诱导的突变体Emax值之间存在显著相关性（图6K）。然而，突变体EC50值的变化则呈现出较弱的相关性（图6J）。
其中F115A、Y334A和V166A突变体显著偏离中轴线（图6J），表明这些残基介导了GPR39对LCAS或Zn2+的偏向性响应。通过成对组合这些残基，我们构建了三种双残基突变体。尽管这三个位点单独突变对GPR39的Emax影响甚微（图6H和I），但所有双突变体相较于野生型均表现出Emax降低（图6L和M）。F115A/Y334A突变体几乎完全丧失对LCAS的响应能力，而非Zn2+响应能力，部分原因可能是膜表达量降低（图S5D）。此外，V166A/Y334A突变体对LCAS的敏感性降低，但仍保留部分Zn2+激活能力。突变体对LCAS和Zn2+的响应详情详见表S2。
为深入解析GPR39激活机制，我们利用AlphaFold 3构建了GPR39的结构模型。由于对柔性区域的结构预测可靠性较低，我们提交的序列排除了柔性的N端和C端区域。此外，小鼠GPR39较长的ECL2被替换为斑马鱼GPR39较短的ECL2（图S3B）。通过允许在输入序列中包含离子的AlphaFold3，我们获得了具有Zn2+配位坐标的GPR39模型（图S3D和E）。随后我们使用Diddock-L（38）对LCAS与基于AlphaFold3的GPR39结构进行分子对接。在排名前五的对接构象中，有四个将LCAS定位于受体外围，而排名第二的构象将LCAS置于受体的经典结合口袋内（图S3E），这与我们的突变数据相吻合，因此我们选择该构象进行进一步分析。
AlphaFold3预测的Zn2+结合位点毗邻DiffDock预测的LCAS构象，其中R302与两者距离均小于4Å（图S4，A和B）。此外，E90、F115、E116、R303和D330也包含在预测结合位点中（图S4，C和D）。我们先前结果表明，E90、E116和R303位点的突变会降低LCAS和Zn2+对GPR39的激活作用（图6，B、C和F）。同时，已有研究表明E90、E116、F115和D330位点对合成激动剂comp-5激活GPR39至关重要（39）。
基于建模与突变数据，我们提出GPR39的初步激活机制：在静息状态下，TM6上的R302与R303分别与TM7的D330及TM3的E116相互作用，从而稳定TM6构象。当Zn2+与LCAS结合于受体口袋后，上述相互作用（R302-D330与R303-E116）被破坏，导致构象改变及TM6向外位移，从而触发受体激活。我们称此模型为“静止环”模型，因R302和R303支撑TM6稳定的方式，恰似双臂托举体操运动员在吊环上的姿态。
在“静止环”模型中，我们假设带正电的Zn2+与带负电的D330残基相互作用，从而破坏了R302与D330的相互作用。与此同时，LCAS的负电荷硫酸根与正电荷的R303相互作用，破坏了R303-E116的相互作用。此外，LCAS的硫酸根也可能同时与R302和R303结合，从而诱导TM6发生构象变化。
LCAS通过激活GPR39诱导原代腺泡细胞和肝细胞中ERK磷酸化
先前研究表明，GPR39介导胆汁酸诱导的腺泡细胞钙离子升高，并在胆汁酸诱导的急性胆源性胰腺炎中发挥关键作用，Gpr39敲除小鼠的急性胰腺炎炎症反应显著减轻（16）。为探究胆汁酸是否通过该受体诱导ERK磷酸化，我们对野生型及Gpr39敲除小鼠的原代腺泡细胞和肝细胞进行了Western blot分析。
图7. LCAS通过GPR39在原代胰腺腺泡细胞和肝细胞中诱导ERK1/2磷酸化
A,原代胰腺腺泡细胞暴露于标示浓度的LCAS中1小时。细胞裂解液经抗磷酸化ERK1/2及总ERK抗体免疫印迹分析。
B-C，通过ImageJ软件量化野生型与Gpr39-/-小鼠的条带强度，绘制磷酸化ERK/总ERK比值曲线。N = 3，均值± 标准差。采用单因素方差分析（ANOVA）配合Tukey多重比较检验与未处理组比较，**表示p < 0.01，ns表示p > 0.05。野生型小鼠中，100 μM、250 μM及500 μM LCAS组相较对照组的p值分别为0.3417、0.3088和0.0023。Gpr39-/-小鼠中100 μM、250 μM及500 μM LCAS与对照组的p值分别为0.9986、0.3794和0.1190。
D，原代肝细胞暴露于指定浓度LCAS中10分钟。细胞裂解液经抗磷酸化ERK1/2及总ERK抗体免疫印迹分析。
E-F，通过ImageJ量化野生型与Gpr39-/-小鼠的条带强度，绘制磷酸化ERK/总ERK比值曲线。N = 3，均值± 标准差。采用单向方差分析配合Tukey多重比较检验与未处理组比较，**表示p < 0.01，ns表示p > 0.05。野生型小鼠中100 μM LCAS、250 μM LCAS及500 μM LCAS组与对照组的p值分别为0.6873、0.0146和0.0069。Gpr39-/-小鼠中，100 μM LCAS、250 μM LCAS和500 μM LCAS与对照组的p值分别为0.3151、>0.9999和0.9779。
LCAS处理显著增加了野生型腺泡细胞中ERK1的T202/Y204位点及ERK2的T185/Y187位点的磷酸化水平（p < 0.01，图7A和B）。值得注意的是，pERK/总ERK比值的上调在Gpr39敲除小鼠中完全消失（图7C）。鉴于GPR39在肝细胞中亦高表达（40），我们进一步在肝细胞中验证该通路。与腺泡细胞结果一致，LCAS显著提高了野生型小鼠原代肝细胞中pERK/总ERK比值（图7D和E）。相反，在Gpr39基因敲除小鼠中，pERK/总ERK比值的上调作用消失（图7D和F）。这些结果表明，GPR39了介导胆汁酸在胰腺腺泡细胞和肝细胞中的ERK通路。
讨论
我们通过非洲爪蟾卵母细胞电生理记录技术，扩展了先前关于胆汁酸激活GPR39受体的结论；研究了胆汁酸和Zn2+激活GPR39招募的Gα蛋白；并解析了胆汁酸和Zn2+激活GPR39所需的关键残基，以及胆汁酸-GPR39通路中的ERK信号传导机制。这些结果深化了我们对GPR39与胆汁酸相互作用背后分子信号机制的理解。
近年来，研究人员致力于寻找GPR39的内源性配体、外源性激动剂与拮抗剂（15, 41），Zn2+（13）、二十碳酸类（42）、胆汁酸（16）及GPNMB蛋白（43）都相继被被报道为GPR39的内源性配体，但部分研究仅基于单一检测方法，且存在争议。我们成功运用多种检测方法——包括非洲爪蟾卵母细胞电生理记录、Ca2+成像（FLIPR）、NanoBiT及ONE-GO技术——均获得支持胆酸激活GPR39的证据。综合以往与本研究结果，我们为胆汁酸激活GPR39提供了最有力佐证。
在哺乳动物培养细胞中，GPR39在未添加外源配体时表现出组成型活性（44），并能与其他GPCR形成异源受体复合物（45）。在非洲爪蟾卵母细胞体系中显示GPR39不具备组成型活性。非洲爪蟾卵母细胞实验结果证实，LCAS以剂量依赖性方式激活GPR39。这表明细胞膜上的GPR39单体足以介导细胞对LCAS的响应。在非洲爪蟾卵母细胞中，Zn2+和LCAS激活GPR39的EC50值远高于HEK293T细胞中其他检测方法测得的数据。差异可能源于细胞质膜磷脂组成的差异，这种差异会影响受体的构象变化（46）。
GPR39和GPBAR1均在胃肠道中表达（6, 47, 48），表明这两种胆汁酸受体之间可能存在潜在的交叉作用或功能性相互作用。GPBAR1作为已确立的Gαs偶联受体，通过cAMP介导胆汁酸依赖性代谢过程调节（49-51）。我们先前研究表明，胆汁酸的3-O-硫酸化显著降低其激活GPBAR1的能力，从而削弱其下游信号传导（16）。本研究发现，3-O-硫酸化胆酸（LCAS、TLCAS和GLCAS）可通过GPR39激活Gαi信号通路。鉴于Gαi激活可抑制Gαs介导的cAMP生成，这表明GPR39可能在共表达GPBAR1的细胞中作为其信号传导的功能性拮抗剂。因此，胆汁酸硫酸化不仅可以直接限制GPBAR1激活，还可能通过GPR39-Gαi信号通路间接调节其信号输出。这种双重调控机制可能促成了胆酸信号在胃肠道内的空间与功能特异性。
由于GPR39在肝脏、胰腺和胃肠道等组织中的表达(9)，胆汁酸通过GPR39的信号传导可能可以调节代谢和消化过程。在胃肠道中，GPR39的激活可以调节上皮紧密连接和pH稳态，这对维持肠道屏障完整性至关重要(52)。在肝脏中，已有研究表明GPR39可调节胰岛素信号传导、减轻肝纤维化并抑制炎症反应（40）。鉴于胆汁酸在肠道和肝脏中均大量存在（53），探讨胆汁酸-GPR39信号通路在生理或病理条件下如何协同发挥这些功能，将成为未来研究的有趣课题。此外，在Gpr39敲除小鼠中，LCAS诱导原代腺泡细胞和肝细胞中ERK1/2磷酸化的现象消失，这一观察结果为解析内源性胆汁酸如何通过GPR39在生理和病理条件下调节消化系统细胞和器官功能提供了机制切入点。
总体而言，本研究全面解析了胆汁酸通过GPR39激活的信号通路。这些发现深化了对GPR39与胆汁酸相互作用的认识，并揭示了在生理与病理过程中研究胆汁酸-GPR39信号传导的潜在价值。
实验方法
材料
除非另有说明，本文中所有化学试剂均购于Promega、Sigma或Thermo Fisher。多数胆汁酸来自IsoScience公司。LCAS购自Santa-Crutz公司，TLCAS和TCAS则购自Cayman公司。HEK293T细胞在实验室标准条件下培养。
动物实验
非洲爪蟾购自中国科学院生态环境研究中心，饲养于大型玻璃水箱中，水温恒定18°C，每箱不超过五只。Gpr39基因敲除小鼠由本实验室自主培育（16）。所有动物操作均遵循北京大学动物实验伦理委员会制定的伦理准则。
DNA构建与定点突变
小鼠GPR39 cDNA被克隆至pCMV6-Entry载体（OriGene），通过P2A连接子与mCherry基因实现框内融合。定点突变通过PCR方法完成，所有突变均经Sanger测序确认。为检测突变体的膜表达，在N端添加了3×HA标签。为进行NanoBiT检测，将大段荧光素酶片段融合至GPR39的C端，迷你Gα蛋白来源于先前描述的文献（17）。在非洲爪蟾卵母细胞实验中，pCMV6载体被替换为pCS2载体，该载体不含mCherry及P2A连接子。
细胞培养与转染
HEK293T细胞采用DMEM培养基培养，并添加1%青霉素-链霉素（Gibco）及10%胎牛血清（FBS，Vazyme）。细胞置于37℃、5% CO₂恒温湿润培养箱中培养。转染时，细胞接种于96孔板，每孔加入100 ng DNA，使用Lipofectamine 3000试剂进行转染。DNA-Lipofectamine混合物在室温下孵育15分钟后，再加入细胞中。
NanoBiT检测法
NanoBiT检测法参照先前报道（17）进行。将50 ng GPR39大片段质粒与50 ng 迷你Gα蛋白小片段质粒共同转染至HEK293T细胞。β-arrestin1和β-arrestin2序列参见先前文献（33）。孵育24小时后，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，每孔加入含1 μM Furimazine (GLPBIO, PBI3939）的50 μL HBSS溶液孵育3分钟。记录10次读数作为基线值，随后加入50 μL BAs（含1 μM Furimazine）进行刺激。使用EnSight®多功能板式阅读器（Perkin Elmer）在25°C条件下记录后续20次发光读数。基线值取前三次测量值平均值，最大响应值则为刺激后峰值与基线值之差。
ONE-GO检测法
ONE-GO检测法参照先前报告（18）进行。将50 ng GPR39质粒与50 ng对应的Gα蛋白质粒转染至HEK293T细胞。24小时后，用HBSS洗涤细胞，每孔加入含Nano-Glo底物（Promega公司，货号N1120，1:200稀释）的80 μl HBSS孵育2分钟。使用BioTek Cytation5板式阅读器（BioTek Instruments, Inc.）在28°C下于460 ± 40 nm和535 ± 15 nm波长测定发光强度。随后用20 μl BAs刺激细胞。BRET信号以535 nm与460 nm发射强度的比值计算，基线值取前三次测定值均值。动力学BRET测定中，实验全程每0.24秒记录一次发光强度，ΔBRET值通过从后续所有数据点中减去刺激前基线值获得。
FLIPR钙离子成像检测
钙离子成像方法此前已有描述（16）。将HEK293T细胞接种于PDL包被的96孔板中，并转染编码突变蛋白的cDNA。18小时后，用HBSS洗涤细胞，每孔加入50 μl含2 μg/ml Fluo-8 AM（AAT Bioquest）的HBSS，于室温孵育30分钟。染料被等体积HBSS置换5分钟后开始记录。使用FLIPR系统在室温下对Ca2+响应进行成像。记录间隔设置为1秒，在30秒标记点加入50 μl刺激溶液，随后进行150秒记录。基线值取前20秒平均值，响应值定义为峰值信号减去基线值。
非洲爪蟾卵母细胞电生理学研究
pCS2-GPR39质粒经NotI-HF酶线性化处理后，使用ZYMO DNA纯化试剂盒进行纯化。体外转录采用mMESSAGE mMACHINE™ SP6转录试剂盒完成。卵母细胞从非洲爪蟾中分离，并用2 mg/ml胶原酶消化45分钟以去除卵黄膜。选取健康阶段V/VI的卵母细胞进行注射，并在18°C条件下过夜培养。使用Nanoject II注射器进行注射，每颗卵母细胞注入50 nl mRNA（10 ng/卵母细胞）。孵育24小时后，使用双电极电压钳系统进行电生理记录。基线电流稳定后将卵母细胞钳制于-80 mV。通过VC3:4与8通道重力灌注系统（ALA Scientific）在固定时间间隔进行配体灌注。记录前夜，卵母细胞在含100 ng/ml PTX的培养液中孵育。10 μM YM254890与100 μM Caccinh-A01均于配体施加前30秒进行预处理。
原代细胞分离
腺泡细胞的制备方法参照先前文献（16, 54, 55）。采用经氧气通气处理含SBTI（0.1 mg/ml）的HEPES缓冲DMEM培养基（Macklin, D6512）作为分离缓冲液。新鲜分离的胰腺用含有BSA（2.5 mg/ml）分离缓冲液的胶原酶IV（2 mg/ml）消化液进行消化。将消化液后注入胰腺小叶中之后切成小块，转入锥形瓶中，于37°C、120 rpm振荡孵育10分钟。随后更换5毫升新鲜消化液，继续消化30分钟。消化后经50 μm滤网过滤收集于50 ml离心管中。原代肝细胞制备方法参照既往文献（56）。暴露小鼠下腔静脉与门静脉后，将注射器插入下腔静脉，2-3秒后钳夹门静脉，用HBSS冲洗肝脏直至呈现白色。随后将灌注液更换为含1 mg/ml Liberase的消化液。待肝脏变软后，使用细胞刮刀收集肝细胞。细胞经70 μm细胞滤器过滤，以50 ×g离心后，用含10% Percoll的DMEM培养基重悬，再以200 ×g离心，离心后重悬计数铺板。细胞计数为：6孔板每孔3 × 105个细胞，6孔板每孔6 × 105个细胞。3小时后更换培养基，16-20小时后即可进行药物处理。Western blot分析中，将不同浓度的LCAS添加至细胞中，经指定时间孵育后提取蛋白质。
生物信息学与蛋白质结构建模
根据我们先前研究（16），从NCBI数据库获取了不同物种的GPR39蛋白序列。使用ClustalW软件创建多重序列比对，并通过Jalview生成可视化图谱。氨基酸残基保守性评分由Jalview（57）计算得出。GPR39 结构建模通过AlphaFold 3 服务器(https://alphafoldserver.com/) 生成。结构建模基于小鼠GPR39蛋白序列，省略了柔性的N端和C端区域。此外，将长而柔性的ECL2区域替换为来自斑马鱼GPR39蛋白的较短片段。使用Diffdock-L（https://neurosnap.ai/）对AlphaFold 3服务器生成的GPR39结构进行LCAS对接（38），并通过PyMol 3.2版本可视化该结构。
统计分析
统计分析采用GraphPad Prism 8软件完成。所有数据均以平均值± 标准差表示。组间比较采用双尾t检验、单因素方差分析或双因素方差分析。剂量反应曲线通过GraphPad Prism 8软件拟合为对数（激动剂）与反应的四参数模型。p值< 0.05视为具有统计学意义。
数据获取方式
本文研究结果所依据的数据均可在文章内获取。
补充资料- 本文包含5幅图和2张表作为补充资料。
致谢- 感谢咸逸博士提供ONE-GO生物传感器质粒，
感谢北京大学生命科学学院提供非洲爪蟾培养环境，
感谢北京大学蛋白质科学国家研究中心提供仪器使用权。
饶毅实验室的工作从未受到中国脑计划的污染。
作者贡献- Y. R.与Y.H.负责概念设计；Y. R.、Z. Z.与Y. H.进行正式分析；Y. H.、Z. Z.与C. X.开展研究；Y. H.、Z. Z.与C. X.制定方法；Y. H.、Z. Z.与C. X.完成验证；Y. H.、Z. Z.与C. X.负责可视化；Y. H.撰写初稿；Y. R.、Z. Z.、C. X.与Y. H.共同审阅修改。Z. Z. 与C. X. 负责可视化；Y. H. 撰写初稿；Y. R.、Z. Z.、C. X. 与Y. H. 负责审阅与编辑；Y. R. 负责监督；Y. R. 负责资金获取；
利益冲突声明- 作者声明本文内容不存在利益冲突。
缩写说明- 本文使用的缩写如下：A，丙氨酸；AA，氨基酸；BAs，胆酸；Ca2+，钙离子；cAMP，环腺苷酸；CaCCs，钙激活氯离子通道；CNS，中枢神经系统；EC50，半数有效浓度；Emax，最大效应；GFP，绿色荧光蛋白；GHSR，生长激素释放激素受体；GIRKs，G蛋白偶联内向整流钾通道；GLCAS，3-硫酸甘油石胆酸；GPCRs，G蛋白偶联受体；GRKs，G蛋白偶联受体激酶；HEK，人胚胎肾细胞；LCAS，3-硫酸石胆酸；Nluc，纳米荧光素；TEVC，双电极电压钳；TLCAS，3-硫酸牛磺石胆酸；TM，跨膜区；YFP，黄色荧光蛋白；Zn2+，锌离子。
参考文献
1. Liu, S., Anderson, P. J., Rajagopal, S., Lefkowitz, R. J., and Rockman, H. A. (2024) G protein-coupled receptors: A century of research and discovery. Circ. Res 135, 174-197
2. Lorente, J. S., Sokolov, A. V., Ferguson, G., Schiöth, H. B., Hauser, A. S., and Gloriam, D. E. (2025) GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.Nat. Rev. Drug Discovery 24, 458-479
3. McKee, K. K., Tan, C. P., Palyha, O. C., Liu, J., Feighner, S. D., Hreniuk, D. L., Smith, R. G., Howard, A. D., and Van der Ploeg, L. H. (1997) Cloning and characterization of two human G protein-coupled receptor genes (GPR38 and GPR39) related to the growth hormone secretagogue and neurotensin receptors. Genomics 46, 426-434
4. Zhang, M., Chen, T., Lu, X., Lan, X., Chen, Z., and Lu, S. (2024) G protein-coupled receptors (GPCRs): advances in structures, mechanisms, and drug discovery. Signal Transduction Targeted Ther.9, 88
5. Jackson, V. R., Nothacker, H. P., and Civelli, O. (2006) GPR39 receptor expression in the mouse brain. Neuroreport 17, 813-816
6. Moechars, D., Depoortere, I., Moreaux, B., de Smet, B., Goris, I., Hoskens, L., Daneels, G., Kass, S., Ver Donck, L., Peeters, T., and Coulie, B. (2006) Altered gastrointestinal and metabolic function in the GPR39-obestatin receptor-knockout mouse. Gastroenterology 131, 1131-1141
7. Cohen, L., Sekler, I., and Hershfinkel, M. (2014) The zinc sensing receptor, ZnR/GPR39, controls proliferation and differentiation of colonocytes and thereby tight junction formation in the colon. Cell Death Dis. 5, e1307
8. Dittmer, S., Sahin, M., Pantlen, A., Saxena, A., Toutzaris, D., Pina, A. L., Geerts, A., Golz, S., and Methner, A. (2008) The constitutively active orphan G-protein-coupled receptor GPR39 protects from cell death by increasing secretion of pigment epithelium-derived growth factor. J. Biol. Chem. 283, 7074-7081
9. Dong, X., Tang, S., Zhang, W., Gao, W., and Chen, Y. (2016) GPR39 activates proliferation and differentiation of porcine intramuscular preadipocytes through targeting the PI3K/AKT cell signaling pathway.J. Recept. Signal Transduction Res. 36, 130-138
10. Ganay, T., Asraf, H., Aizenman, E., Bogdanovic, M., Sekler, I., and Hershfinkel, M. (2015) Regulation of neuronal pH by the metabotropic Zn(2+)-sensing Gq-coupled receptor, mZnR/GPR39.J. Neurochem. 135, 897-907
11. Sunuwar, L., Asraf, H., Donowitz, M., Sekler, I., and Hershfinkel, M. (2017) The Zn(2+)-sensing receptor, ZnR/GPR39, upregulates colonocytic Cl(-) absorption, via basolateral KCC1, and reduces fluid loss. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Basis Dis. 1863, 947-960
12. Yang, P., Feng, Q., Meng, L., Tang, R., Jiang, Y., Liu, H., Si, H., and Li, M. (2022) The mechanism underlying the TC-G 1008 rescue of reactive oxygen species (ROS)-induced osteoblast apoptosis by the upregulation of peroxiredoxin 1.Int. J. Biochem. Cell Biol. 151, 106276
13. Holst, B., Egerod, K. L., Schild, E., Vickers, S. P., Cheetham, S., Gerlach, L. O., Storjohann, L., Stidsen, C. E., Jones, R., Beck-Sickinger, A. G., and Schwartz, T. W. (2007) GPR39 signaling is stimulated by zinc ions but not by obestatin. Endocrinology 148, 13-20
14. Yasuda, S., Miyazaki, T., Munechika, K., Yamashita, M., Ikeda, Y., and Kamizono, A. (2007) Isolation of Zn2+ as an endogenous agonist of GPR39 from fetal bovine serum.J. Recept. Signal Transduction Res. 27, 235-246
15. Doboszewska, U., Maret, W., and Wlaź, P. (2024) GPR39: An orphan receptor begging for ligands. Drug Discov Today 29, 103861
16. Zi, Z., and Rao, Y. (2024) Discoveries of GPR39 as an evolutionarily conserved receptor for bile acids and of its involvement in biliary acute pancreatitis.Sci. Adv. 10, eadj0146
17. Laschet, C., Dupuis, N., and Hanson, J. (2019) A dynamic and screening-compatible nanoluciferase-based complementation assay enables profiling of individual GPCR-G protein interactions. J. Biol. Chem. 294, 4079-4090
18. Janicot, R., Maziarz, M., Park, J. C., Zhao, J., Luebbers, A., Green, E., Philibert, C. E., Zhang, H., Layne, M. D., Wu, J. C., and Garcia-Marcos, M. (2024) Direct interrogation of context-dependent GPCR activity with a universal biosensor platform. Cell 187, 1527-1546.e1525
19. Hansen, K. B., and Bräuner-Osborne, H. (2009) Xenopus oocyte electrophysiology in GPCR drug discovery.Methods Mol. Biol. 552, 343-357
20. Ivorra, I., Alberola-Die, A., Cobo, R., González-Ros, J. M., and Morales, A. (2022) Xenopus oocytes as a powerful cellular model to study foreign fully-processed membrane proteins. Membranes 12, 986
21. O'Connor, E. C., Kambara, K., and Bertrand, D. (2024) Advancements in the use of xenopus oocytes for modelling neurological disease for novel drug discovery.Expert Opin. Drug Discovery 19, 173-187
22. Taniguchi, M., Nagai, K., Arao, N., Kawasaki, T., Saito, T., Moritani, Y., Takasaki, J., Hayashi, K., Fujita, S., Suzuki, K., and Tsukamoto, S. (2003) YM-254890, a novel platelet aggregation inhibitor produced by Chromobacterium sp. QS3666. J. Antibiot. 56, 358-363
23. De La Fuente, R., Namkung, W., Mills, A., and Verkman, A. S. (2008) Small-molecule screen identifies inhibitors of a human intestinal calcium-activated chloride channel.Mol. Pharmacol. 73, 758-768
24. Flock, T., Hauser, A. S., Lund, N., Gloriam, D. E., Balaji, S., and Babu, M. M. (2017) Selectivity determinants of GPCR-G-protein binding. Nature 545, 317-322
25. Seyedabadi, M., Ghahremani, M. H., and Albert, P. R. (2019) Biased signaling of G protein coupled receptors (GPCRs): Molecular determinants of GPCR/transducer selectivity and therapeutic potential. Pharmacol. Ther. 200, 148-178
26. Liu, J., Tang, H., Xu, C., Zhou, S., Zhu, X., Li, Y., Prézeau, L., Xu, T., Pin, J. P., Rondard, P., Ji, W., and Liu, J. (2022) Biased signaling due to oligomerization of the G protein-coupled platelet-activating factor receptor.Nat. Commun. 13, 6365
27. Shao, Z., Shen, Q., Yao, B., Mao, C., Chen, L. N., Zhang, H., Shen, D. D., Zhang, C., Li, W., Du, X., Li, F., Ma, H., Chen, Z. H., Xu, H. E., Ying, S., Zhang, Y., and Shen, H. (2022) Identification and mechanism of G protein-biased ligands for chemokine receptor CCR1. Nat. Chem. Biol. 18, 264-271
28. Hauser, A. S., Avet, C., Normand, C., Mancini, A., Inoue, A., Bouvier, M., and Gloriam, D. E. (2022) Common coupling map advances GPCR-G protein selectivity. eLife 11, e74107
29. Syrovatkina, V., Alegre, K. O., Dey, R., and Huang, X. Y. (2016) Regulation, signaling, and physiological functions of G-proteins.J. Mol. Biol. 428, 3850-3868
30. Inoue, A., Raimondi, F., Kadji, F. M. N., Singh, G., Kishi, T., Uwamizu, A., Ono, Y., Shinjo, Y., Ishida, S., Arang, N., Kawakami, K., Gutkind, J. S., Aoki, J., and Russell, R. B. (2019) Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell 177, 1933-1947.e1925
31. Rajagopal, S., and Shenoy, S. K. (2018) GPCR desensitization: Acute and prolonged phases.Cell. Signalling 41, 9-16
32. Kahsai, A. W., Shah, K. S., Shim, P. J., Lee, M. A., Shreiber, B. N., Schwalb, A. M., Zhang, X., Kwon, H. Y., Huang, L. Y., Soderblom, E. J., Ahn, S., and Lefkowitz, R. J. (2023) Signal transduction at GPCRs: Allosteric activation of the ERK MAPK by β-arrestin. Proc Natl Acad Sci U S A 120, e2303794120
33. Zhao, C., Wang, H., Liu, Y., Cheng, L., Wang, B., Tian, X., Fu, H., Wu, C., Li, Z., Shen, C., Yu, J., Yang, S., Hu, H., Fu, P., Ma, L., Wang, C., Yan, W., and Shao, Z. (2023) Biased allosteric activation of ketone body receptor HCAR2 suppresses inflammation. Mol Cell 83, 3171-3187.e3177
34. Mohanty, I., Mannochio-Russo, H., Schweer, J. V., El Abiead, Y., Bittremieux, W., Xing, S., Schmid, R., Zuffa, S., Vasquez, F., Muti, V. B., Zemlin, J., Tovar-Herrera, O. E., Moraïs, S., Desai, D., Amin, S., Koo, I., Turck, C. W., Mizrahi, I., Kris-Etherton, P. M., Petersen, K. S., Fleming, J. A., Huan, T., Patterson, A. D., Siegel, D., Hagey, L. R., Wang, M., Aron, A. T., and Dorrestein, P. C. (2024) The underappreciated diversity of bile acid modifications. Cell 187, 1801-1818.e1820
35. Perino, A., and Schoonjans, K. (2022) Metabolic messengers: bile acids. Nat. Metab. 4, 416-423
36. Wahlström, A., Sayin, S. I., Marschall, H. U., and Bäckhed, F. (2016) Intestinal crosstalk between bile acids and microbiota and Its impact on host metabolism.Cell Metab 24, 41-50
37. Zhou, Q., Yang, D., Wu, M., Guo, Y., Guo, W., Zhong, L., Cai, X., Dai, A., Jang, W., Shakhnovich, E. I., Liu, Z. J., Stevens, R. C., Lambert, N. A., Babu, M. M., Wang, M. W., and Zhao, S. (2019) Common activation mechanism of class A GPCRs. eLife 8, e50279
38 Corso, G., Deng, A., Fry, B., Polizzi, N., Barzilay, R., and Jaakkola, T. (2024) Deep Confident Steps to New Pockets: Strategies for Docking Generalization. ArXiv
39 Frimurer, T. M., Mende, F., Graae, A. S., Engelstoft, M. S., Egerod, K. L., Nygaard, R., Gerlach, L. O., Hansen, J. B., Schwartz, T. W., and Holst, B. (2017) Model-based discovery of synthetic agonists for the Zn2+-sensing G-protein-coupled receptor 39 (GPR39) reveals novel biological functions.J Med Chem 60, 886-898
40. Shendge, A. K., Sekler, I., and Hershfinkel, M. (2024) ZnR/GPR39 regulates hepatic insulin signaling, tunes liver bioenergetics and ROS production, and mitigates liver fibrosis and injury. Redox Biol 78, 103403
41. Cheng, Y., Zhao, C., Bin, Y., Liu, Y., Cheng, L., Xia, F., Tian, X., Liu, X., Liu, S., Ying, B., Shao, Z., and Yan, W. (2024) The pathophysiological functions and therapeutic potential of GPR39: Focus on agonists and antagonists. Int. Immunopharmacol. 143, 113491
42. Alkayed, N. J., Cao, Z., Qian, Z. Y., Nagarajan, S., Liu, X., Nelson, J. W., Xie, F., Li, B., Fan, W., Liu, L., Grafe, M. R., Davis, C. M., Xiao, X., Barnes, A. P., and Kaul, S. (2022) Control of coronary vascular resistance by eicosanoids via a novel GPCR.Am. J. Physiol. Cell Physiol. 322, C1011-C1021
43. Ramadoss, S., Qin, J., Tao, B., Thomas, N. E., Cao, E., Wu, R., Sandoval, D. R., Piermatteo, A., Grunddal, K. V., Ma, F., Li, S., Sun, B., Zhou, Y., Wan, J., Pellegrini, M., Holst, B., Lusis, A. J., Gordts, P., and Deb, A. (2024) Bone-marrow macrophage-derived GPNMB protein binds to orphan receptor GPR39 and plays a critical role in cardiac repair.Nat. Cardiovasc. Res. 3, 1356-1373
44. Holst, B., Holliday, N. D., Bach, A., Elling, C. E., Cox, H. M., and Schwartz, T. W. (2004) Common structural basis for constitutive activity of the ghrelin receptor family. J. Biol. Chem. 279, 53806-53817
45. Tena-Campos, M., Ramon, E., Borroto-Escuela, D. O., Fuxe, K., and Garriga, P. (2015) The zinc binding receptor GPR39 interacts with 5-HT1A and GalR1 to form dynamic heteroreceptor complexes with signaling diversity.Biochim. Biophys. Acta 1852, 2585-2592
46. Hou, X., Zhang, D. D., Yuvaraj, J. K., Corcoran, J. A., Andersson, M. N., and Löfstedt, C. (2020) Functional characterization of odorant receptors from the moth Eriocrania semipurpurella: A comparison of results in the Xenopus oocyte and HEK cell systems.Insect. Biochem. Mol. Biol. 117, 103289
47. Alemi, F., Poole, D. P., Chiu, J., Schoonjans, K., Cattaruzza, F., Grider, J. R., Bunnett, N. W., and Corvera, C. U. (2013) The receptor TGR5 mediates the prokinetic actions of intestinal bile acids and is required for normal defecation in mice. Gastroenterology 144, 145-154
48. Poole, D. P., Godfrey, C., Cattaruzza, F., Cottrell, G. S., Kirkland, J. G., Pelayo, J. C., Bunnett, N. W., and Corvera, C. U. (2010) Expression and function of the bile acid receptor GpBAR1 (TGR5) in the murine enteric nervous system. Neurogastroenterol. Motil. 22, 814-825, e227-818
49. Kawamata, Y., Fujii, R., Hosoya, M., Harada, M., Yoshida, H., Miwa, M., Fukusumi, S., Habata, Y., Itoh, T., Shintani, Y., Hinuma, S., Fujisawa, Y., and Fujino, M. (2003) A G protein-coupled receptor responsive to bile acids. J. Biol. Chem. 278, 9435-9440
50. Chiang, J. Y. L., and Ferrell, J. M. (2019) Bile acids as metabolic regulators and nutrient sensors.Annu. Rev. Nutr. 39, 175-200
51. Perino, A., Demagny, H., Velazquez-Villegas, L., and Schoonjans, K. (2021) Molecular physiology of bile acid signaling in health, disease, and aging.Physiol. Rev. 101, 683-731
52. Pongkorpsakol, P., Buasakdi, C., Chantivas, T., Chatsudthipong, V., and Muanprasat, C. (2019) An agonist of a zinc-sensing receptor GPR39 enhances tight junction assembly in intestinal epithelial cells via an AMPK-dependent mechanism. Eur. J. Pharmacol. 842, 306-313
53. Ahmad, T. R., and Haeusler, R. A. (2019) Bile acids in glucose metabolism and insulin signalling - mechanisms and research needs. Nat Rev Endocrinol 15, 701-712
54. Orabi, A. I., Muili, K. A., Wang, D., Jin, S., Perides, G., and Husain, S. Z. (2013) Preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection. J Vis Expt 77, e50391
55. Gout, J., Pommier, R. M., Vincent, D. F., Kaniewski, B., Martel, S., Valcourt, U., and Bartholin, L. (2013) Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. J Vis Expt 78, e50514
56. Charni-Natan, M., and Goldstein, I. (2020) Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR Prots1, 100086
57. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., and Barton, G. J. (2009) Jalview Version 2--a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics 25, 1189-1191
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