《自然-生物技术》新文上线︱西湖大学章永登团队开发纳米尺度超分辨成像技术me4Pi-SMLM

研究背景 

      单分子定位成像技术（SMLM）因其高分辨率和单分子灵敏度，被广泛应用于亚细胞结构与蛋白质复合物的原位解析。然而，传统三维SMLM的轴向分辨率显著低于横向，存在2–3倍的各向异性差异。基于双物镜架构的4Pi-SMLM可将轴向定位精度提升约5倍，实现10–15 nm的各向同性分辨率，但系统结构复杂、配准困难，对环境漂移和振动敏感，硬件与维护成本高昂，制约了其在普通实验室中的推广。因此，亟需发展一种兼具4Pi级三维高精度、低成本、高稳定性和易操作性的干涉定位成像方法。

结果与展望

      针对上述挑战，本研究开发了镜面增强4Pi单分子定位成像技术（me4Pi-SMLM）。该技术摒弃传统双物镜设计，仅使用单个高数值孔径物镜，并在样品上方放置一面反射镜，通过反射激发光形成相位可调制的轴向驻波干涉条纹。配合压电促动器实现毫秒级精确位移，系统依次采集三幅相位图像完成干涉定位，使轴向定位精度提升约5倍（图1a-c）。相比传统4Pi-SMLM，me4Pi-SMLM简化了光机结构，自参考干涉机制增强了系统抗振动能力，降低了光路重校准频率，在减少硬件成本的同时提升了运行稳定性。

      在生物样品测试中，me4Pi-SMLM实现了三维2–3 nm的近各向同性定位精度，清晰解析了微管的中空结构、核孔复合物的亚基排布以及内质网片层等超微结构（图1d-g），成像性能与传统4Pi-SMLM相当。凭借简化的光学设计与良好的样品兼容性，该技术成功拓展至多种应用场景：活细胞成像实现40–60 nm三维超分辨；单分子追踪达到三维6 nm定位精度和9 ms时间分辨率；30微米厚脑组织切片成像实现优于15 nm的三维分辨率。此外，me4Pi-SMLM具备良好的兼容性，现有三维SMLM系统仅需增加反射镜和压电促动器即可完成升级。

图1、me4Pi-SMLM超分辨成像系统。（a）系统原理图。（b）不同相位和轴向位置PSF示意图。（c）轴向干涉调制模块。（d）解析微管中空结构。（e）固定细胞单分子定位精度。（f-g）解析核孔复合物32个蛋白亚基结构。

      综上，me4Pi-SMLM技术为分子尺度亚细胞结构解析提供了兼顾性能与实用性的成像平台，有望推动干涉定位超分辨成像在更广泛生物学研究中的应用。

作者简介   

      西湖大学章永登研究员为本论文通讯作者，其团队博士生于紫荆（与复旦大学联合培养）和助理研究员郑贝博士为共同第一作者。课题组长期致力于新型超分辨率荧光显微成像技术的研发与应用，旨在为揭示纳米尺度下亚细胞精细结构与动态行为提供先进的成像工具。（实验室主页：https://www.westlake.edu.cn/faculty/yongdeng-zhang.html）。

《自然-生物技术》Nature Biotechnology

DOI：10.1038/s41587-026-03083-7

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Mirror-enhanced 4Pi-SMLM with one objective enables isotropic nanoscale imaging

《自然-生物技术》

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