点亮过氧化氢

Nature Chemical Biology | Volume 22 | April 2026 | 568–579

一种定制化显色的过氧化氢荧光传感器

Ekaterina S. Potekhina、Dina I. Bass、Daria Ezeriņa 

摘要

过氧化氢（H₂O₂）是重要的信号分子和正常细胞代谢的氧化还原调节剂，也是氧化应激的主要组成部分。本研究报道了一种源自 HyPer 家族的传感器 HyPerFLEX（具有灵活荧光团激发特性的 HyPer 传感器），专为活细胞中高精度过氧化氢监测设计。HyPerFLEX 融合了脑膜炎奈瑟氏球菌的氧化还原敏感型 OxyR 结构域与环形重排荧光蛋白 Y-FAST，在 OxyR 被过氧化氢氧化后可产生不依赖氧气的荧光。该传感器能够对活细胞内的过氧化氢动态进行成像，光谱可从绿色调至远红色，适用于多细胞器成像，即使在长期缺氧条件下也能正常工作。与 HyPer7 相比，它在检测超低浓度过氧化氢（如早期葡萄糖刺激胰岛素分泌过程中的过氧化氢）方面更具优势，且能够测量高度氧化性的内质网腔中的过氧化氢水平。这些先进特性和广泛的兼容性使 HyPerFLEX 成为研究氧化应激和细胞信号传导的有力工具。

正文

过氧化氢（H₂O₂）是一种多功能信号分子，由质膜上的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOXs）响应生长因子、激素和细胞因子等刺激产生。线粒体嵴上的电子传递链是过氧化氢的另一个关键来源。尽管其在细胞内的寿命较短 ¹，但它可作为第二信使，通过氧化细胞核及其他细胞区室中氧化还原敏感靶点的巯基，向这些靶点传递信号。

过氧化氢可调节核因子κB（NFκB）²、核因子红细胞 2 相关因子 2（NRF2）³、缺氧诱导因子（HIF）⁴、叉头盒蛋白（FOXO）⁵和 p53（参考文献 6）等转录因子，影响细胞分化、增殖⁷⁻⁸、炎症反应、免疫反应⁹⁻¹⁰、衰老与肿瘤发生 ¹¹⁻¹³、缺氧应答 ¹⁴、应激适应及细胞凋亡 ¹⁵⁻¹⁷。因此，人们对无创成像方法的需求日益增长，希望能够实时可视化不同细胞区室中的过氧化氢动态变化。

基因编码荧光过氧化氢传感器和氧化还原敏感染料的进步，推动了活细胞中过氧化氢信号传导的研究¹⁸⁻²⁰。HyPer 家族过氧化氢传感器（包括 HyPer²¹、HyPer-2（参考文献 22）和 HyPer-3（参考文献 23））采用大肠杆菌的氧化还原敏感型 OxyR-RD 结构域与环形重排黄色荧光蛋白（cpYFP）结合，以检测过氧化氢水平。HyPer 探针需要 pH 对照（如 C199S HyPer）。HyPer7（参考文献 24）采用脑膜炎奈瑟氏球菌的 OxyR-RD 结构域，具有更高的亮度、灵敏度和 pH 响应性。HyPerRed²⁵是唯一的红色过氧化氢探针，可进行双色成像，但动态范围有限且存在 pH 依赖性变异。所有基于绿色荧光蛋白（GFP）的探针均存在一个局限性：发色团成熟依赖氧气 ²⁶，这限制了其在缺氧条件下的成像应用。

本研究中，我们引入了 HyPerFLEX——HyPer 家族的新成员。它将环形重排黄色荧光激活与吸收移位标签（cpY-FAST）整合到脑膜炎奈瑟氏球菌的氧化还原敏感型 OxyR 中，消除了发色团成熟对氧气的依赖性。该传感器可与荧光蛋白（FP）发色团样荧光团（如 4 - 羟基亚苄基罗丹宁（HBR）和 4 - 羟基 - 3 - 甲基亚苄基罗丹宁（HMBR）²⁷）结合，这些荧光团与 Y-FAST 结合后会发出荧光 ²⁸⁻³⁰。在 HyPerFLEX 中，当 OxyR 被过氧化氢氧化时，cpFAST 能有效诱导荧光团荧光强度增强。HyPerFLEX 对过氧化氢具有高灵敏度、可逆性、宽动态范围、不依赖氧气以及光谱可定制等优点。

结果

可定制显色过氧化氢生物传感器的设计

HyPer 家族生物传感器将 OxyR-RD 传感单元与环形重排 GFP 样荧光蛋白相连。为了创建一种高灵敏度、pH 稳定、光稳定且不依赖氧气（O₂）、光谱特性可调节的过氧化氢报告分子，我们采用了脑膜炎奈瑟氏球菌的 OxyR-RD 结构域和环形重排 Y-FAST（cpFAST）。在测试的 OxyR 蛋白中，脑膜炎奈瑟氏球菌的 OxyR 灵敏度最高，也被用于构建 HyPer7（参考文献 24）。

Y-FAST 可与外部 GFP 样荧光团可逆相互作用，允许在厌氧或微需氧条件下进行灵活成像 ³¹⁻³⁶。

我们筛选了亮度最高的 cpFAST 序列文库，在荧光团结合位点附近的柔性环中引入重排，并改变新形成的 N 端和 C 端。最亮的 cpFAST 在 101 和 102 位氨基酸之间形成末端，具有 G101D 和 P102F 突变，以及一个 8 氨基酸的柔性连接子（GGTGGSGG）。

接下来，我们将 cpFAST 通过可变连接子整合到脑膜炎奈瑟氏球菌 OxyR 的 125 和 126 位之间。在细菌培养物中加入 10μM HBR-3,5-DOM 荧光团后，经过氧化氢处理，其中一个变体的荧光强度增加了 30%。进一步优化包括在荧光团结合位点进行突变，并将重排连接子缩短至 4 个氨基酸（GGTG），使得细菌悬液中的响应增加了 73%，HeLa 细胞中的响应增加了约 10 倍。这种优化后的传感器被命名为 HyPerFLEX（具有灵活荧光团激发特性的 HyPer 传感器）（图 1 和扩展数据图 1）。

图 1 HyPerFLEX 的设计

H2O2诱导 OxyR 感知结构域形成二硫键，使荧光团稳定为平面构象并提升荧光强度。本研究证实，可通过选用不同荧光团（如 HBR-3,5-DOM、N871b 与 3a）调控 HyPerFLEX 的光谱特性。

我们在体外对 HyPerFLEX 进行了表征，并将其与荧光团 HBR-3,5-DOM³⁷、N871b（参考文献 30）和 3a（参考文献 28）一起用于活细胞成像。

HyPerFLEX 是一种灵敏且特异的过氧化氢生物传感器

为了对 HyPerFLEX 进行初步体外表征，我们测量了还原态和氧化态 HyPerFLEX 与三种荧光团（HBR-3,5-DOM、N871b 和 3a）结合后的光谱（图 2a 和扩展数据表格 1）。

所有荧光团在氧化后荧光强度均有所增加，其中 3a 的增加幅度最大，这是因为其额外的共轭 π 键系统（图 1）能够稳定激发态并减少非辐射能量损失。

HyPerFLEX 对生物学相关浓度的过氧化氢具有选择性响应（图 2b）。对二酰胺的响应表明，二硫键形成是其作用机制的基础。过氧化氢酶可消除黄嘌呤 / 黄嘌呤氧化酶和过氧亚硝酸盐的响应，表明存在过氧化氢污染 ³⁸。根据所用荧光团的不同，HyPerFLEX 的检测限（LOD）为 10-50nM（图 2c 和扩展数据图 2a、b），使其在体外的灵敏度与 HyPer7 相当（检测限：10-20nM）²⁴。

图 2 |HyPerFLEX 通过两相结合模型特异性与纳摩尔级H2O2反应

a. HyPerFLEX 结合 HBR-3,5-DOM、N871b 与 3a 荧光团的激发与发射光谱。展示 3 次独立实验的代表性光谱。

b. HyPerFLEX 结合不同荧光团的特异性图谱。测试条件包括黄嘌呤 / 黄嘌呤氧化酶体系（X/XO）、过氧化氢酶（Cat，1μM）、甲基胺六亚甲基甲胺诺那酯（MAHMA，NO 供体）、二酰胺（DA）与溶媒（Veh，缓冲液）。信号强度为 a 中测定的激发最大值，归一化至溶媒组。除特殊说明外，每种分析物使用 25 倍摩尔过量。每个点代表单个重复样本，误差线为标准误。

c. HyPerFLEX 的H2O2滴定曲线。信号强度为 a 中测定的激发最大值，归一化至无H2O2组。数据为至少 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

d、e. HyPerFLEX 与 HBR-3,5-DOM（d）、N871b（e）的二级反应速率。插图：>600nm 截止波长下（激发波长 550nm）的荧光增强随时间变化，数据拟合双指数模型得到观测速率常数kobs(fast)，并以H2O2浓度为横坐标绘图。由直线斜率计算二级反应速率常数：HBR-3,5-DOM 组为(2.79±0.23)×104M−1s−1，N871b 组为(1.77±0.24)×104 M−1s−1。数据为 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

f. HyPerFLEX C261S 与 HBR-3,5-DOM 的二级反应速率。插图：>600nm 截止波长下（激发波长 550nm）的荧光增强随时间变化，数据拟合单指数模型得到观测速率常数kobs，并以H2O2浓度为横坐标绘图。由直线斜率计算二级反应速率常数为(1.12±0.13)×105M−1s−1。数据为 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

g. HyPerFLEX 与H2O2的两步反应模型。

为了了解其过氧化氢介导的氧化机制，我们测定了 HyPerFLEX 与 HBR-3,5-DOM 和 N871b 的二级速率常数（图 2d、e），并采用双指数模型拟合（扩展数据图 3f），速率约为 10⁴ M⁻¹ s⁻¹。这表明 HyPerFLEX 的 OxyR 与过氧化氢的反应分为两个步骤（图 2g）：C121 攻击过氧化氢形成亚磺酸（kfast），然后 C261 与亚磺酰化的 C121 反应形成二硫键（kslow）。

为了验证这一机制，我们将 C261 突变为丝氨酸，并重复了停流实验。用 10μM 过氧化氢滴定 1μM HyPerFLEX 会导致快速过度氧化和对空气敏感（扩展数据图 3g），这凸显了二硫键的保护作用。因此，我们用较低浓度的过氧化氢（50-100nM）滴定 HyPerFLEX C261S 突变体（图 2f），观察到单指数曲线（扩展数据图 3h），二级速率常数为 1.12×10⁵ M⁻¹ s⁻¹。这些发现以及 C261S 突变体的绝对 kobs 值较低，证实了 α- 螺旋在稳定荧光团中的作用。

HyPerFLEX 对过氧化氢的响应动力学依赖于 C121 的质子化状态

接下来，我们探究了 HyPerFLEX 的 pH 敏感性 —— 这是含环形重排蛋白的生物传感器普遍存在的问题。早期版本（如 HyPer1-3）对 pH 敏感，而 HyPer7 则表现出比率型 pH 稳定性。对于 HyPerFLEX，其对过氧化氢的响应涉及 C121 与过氧化氢的反应以及随后的荧光团稳定化。我们首先评估了荧光团荧光的 pH 稳定性，发现对于大多数荧光团，无论是结合氧化态还是还原态 HyPerFLEX，在生理 pH 值（6-8）范围内均保持稳定。3a 是一个例外，它表现出轻微的 pH 依赖性，这可能与其尺寸及其与 HyPerFLEX 残基的相互作用有关（图 3a）。

我们进一步利用 HyPerFLEX C261S 突变体，评估了 C121 与过氧化氢的反应是否依赖 pH 值。由于 C121 必须去质子化形成硫醇盐才能发生反应，其可用性由其 pKa 决定（经测定为 7.3）（图 3b）。我们测定了不同 pH 值（6.6（硫醇盐比例 16.6%）、7.0（33.4%）、7.4（55.9%）和 7.8（76%））下 HyPerFLEX C261S 与过氧化氢反应的二级速率常数。

速率常数随 pH 值增加而增大，从 pH7.0 时的 1.7×10⁵ M⁻¹ s⁻¹ 增至 pH7.8 时的 6.8×10⁵ M⁻¹ s⁻¹。在 pH6.6 时，仅在过氧化氢浓度较高时才能检测到响应曲线，且 kobs 值未显示出明显的斜率。

我们的结果表明，HyPerFLEX 对过氧化氢的响应依赖于生理 pH 值下 C121 的硫醇盐可用性。这一发现强调，在比较不同 pH 值细胞器的响应数据时需要格外谨慎。

图 3 HyPerFLEX 的H2O2响应动力学及 C121 与 F130 的作用

a. 布里顿 - 鲁宾逊缓冲液中 HyPerFLEX 还原态与氧化态的 pH 滴定，3a 的激发最大值荧光强度归一化至 pH7 组。展示 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

b. HyPerFLEX C261S 的pKa为 7.3。代表性曲线为 3 次独立实验中，240nm 吸光度归一化至 280nm 后随 pH 的变化。

c. 不同 pH 下 HyPerFLEX C261S 与 HBR-3,5-DOM 的二级反应速率常数。>600nm 截止波长下（激发波长 550nm）的荧光增强随时间变化，拟合单指数模型。速率常数kobs以H2O2浓度为横坐标绘图，由直线斜率计算标注的二级反应速率常数。硫醇盐占比通过亨德森 - 哈塞尔巴尔赫方程估算（pKa=7.3）。pH6.6 对应直线旁的星号表示斜率与零无显著差异。数据为 2 次独立实验的平均值 ± 标准误。

d. AlphaFold2-multimer 预测的 HyPerFLEX 二聚体结构，按 pLDDT 得分着色。

e. 左：同 d 结构，按结构域着色（OxyR 为橙色，cpFAST 为蓝色）；右：OxyR 结构域柔性 α 螺旋放大图。保守的 WxIPTxxx 荧光团结合基序以橙色高亮。

f. 氧化态与还原态 HyPerFLEX 结合不同荧光团的KD与希尔系数。

g. 表达 HyPerFLEX 及其突变体的大肠杆菌（OD600=1）结合 10μM HBR-3,5-DOM 后，对 100μM H2O2的响应曲线。箭头为H2O2添加时间。荧光强度为背景校正信号（未加荧光团的大肠杆菌），激发波长 510nm，发射波长 600nm。展示 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

h. 结合 HBR-3,5-DOM 的 HyPerFLEX 野生型与 F130A 突变体的H2O2滴定曲线。信号强度归一化至无H2O2组。展示 3 次独立实验的平均值 ± 标准误。

HyPerFLEX 为二聚体，在不同氧化状态下荧光团结合特性一致

为了探究 HyPerFLEX 的作用机制，在结晶尝试失败后，我们使用 AlphaFold2-multimer 进行了结构预测。分析型尺寸排阻色谱证实，HyPerFLEX 在所有条件下均以二聚体形式存在（扩展数据图 3a），这与不同生物的 OxyR 调节结构域的同源二聚体排列一致 ³⁹⁻⁴⁴。预测结构的平均局部距离差异测试（pLDDT，残基水平的局部置信度测量）得分为 86.6（图 3d），显示 OxyR 亚基（橙色，图 3e）形成二聚体，而 cpFAST 亚基（蓝色）朝外。过氧化氢敏感半胱氨酸（C121）³⁹标记为红色。WxIPTxxx 基序（橙色，图 3e）与荧光团结合 ²⁷，稳定荧光团并限制其构象灵活性，进而影响其光谱特性⁴⁵。

W251 通过其 ε1 - 亚氨基与五元环的羰基（对于 N871b）形成氢键，影响激活过程⁴⁶。与 “传统” 荧光团不同，HyPerFLEX 的亮度受荧光团解离常数（KD）的影响极小⁴⁷，且在还原态和氧化态之间的结合亲和力无显著变化。KD 值处于低微摩尔范围，协同性极小（N871b 的希尔系数 < 1，3a 的希尔系数 < 2）（图 3f 和扩展数据图 3b）。这表明 HyPerFLEX 依赖于过氧化氢氧化诱导的构象变化（可通过细胞还原机制逆转），而非荧光团结合亲和力的变化。氧化态亮度增加可能是由于结合腔中荧光团的稳定性提高或构象灵活性受限。

F130 通过稳定荧光团介导过氧化氢诱导的强度变化

为了验证图 3d 所示的结构，我们对通过 π- 堆积稳定荧光团的残基 F130 进行了突变。我们将 F130 突变为丙氨酸，并与野生型（WT）相比，评估了其在 HBR-3,5-DOM 存在下对过氧化氢的响应。作为对照，我们将连接子残基 I129 突变为丙氨酸，因为在连接子筛选步骤中已证实该残基的重要性。与 I129A 突变体相比，F130A 突变体完全丧失了对过氧化氢的响应（图 3g）。荧光强度的差异可能源于表达水平的不同（扩展数据图 3c），其中 F130A 突变体表达水平最高，而野生型表达水平最低。用重组野生型和 F130A HyPerFLEX 进行过氧化氢滴定证实了这一结果（图 3h）。圆二色谱（CD）光谱（扩展数据图 3d）表明二级结构无变化，且野生型 HyPerFLEX 氧化时的变化在 F130A 突变体中也存在。这表明响应缺失是由于荧光团结合腔被破坏或稳定化不当所致。HBR-3,5-DOM 与 HyPerFLEX F130A 的 KD 值（扩展数据图 3e）与野生型相似（3.87μM 对 4.19μM），表明尽管荧光团能够结合，但在与过氧化氢反应时可能无法获得强度变化所需的结构稳定化。

HyPerFLEX 可检测不同细胞区室中的过氧化氢

接下来，我们在暴露于不同浓度过氧化氢的 HeLa 细胞中，使用不同荧光团（HBR-3,5-DOM、N871b 和 3a）测试了 HyPerFLEX（图 4a 和扩展数据图 4a-c）。每种荧光团的灵敏度、氧化和还原动力学均有所不同。使用 HBR-3,5-DOM 和 N871b 时，HyPerFLEX 在 1μM 过氧化氢下响应最小，在 7.5μM 过氧化氢下响应最大；使用 3a 时，在 15μM 过氧化氢下响应最大。培养基和细胞质之间的过氧化物梯度经评估为 400 倍；因此，HyPerFLEX 检测到的细胞内过氧化物浓度显著低于添加到培养基中的浓度⁴⁸。使用 HBR-3,5-DOM 的 HyPerFLEX 响应最快，而 3a 的响应较慢（图 4b）。这些差异可能源于每种荧光团的动力学特性、溶解度和膜通透性。尽管氧化态 HyPerFLEX-3a 在体外亮度较高，但其在细胞中的最大信号较低，但由于还原态复合物的荧光更低，仍具有较高的动态范围。

HyPerFLEX 的响应在单个细胞之间也存在差异，这可能是由于细胞抗氧化能力的不同所致。过氧化氢信号传导在活细胞中具有高度区室化特性 ¹，⁴⁹⁻⁵¹。

因此，我们在 HeLa 细胞中测试了定位于不同细胞区室（如细胞核、细胞质、线粒体基质、膜间隙（IMS）、肌动蛋白微丝和内质网（ER））的 HyPerFLEX 变体（图 4c-p）。这些变体定位正确，且对外源过氧化氢表现出显著响应。即使在高度氧化的区室中，定位于线粒体膜间隙和内质网腔的 HyPerFLEX 对外源过氧化氢也表现出剂量依赖性响应（扩展数据图 4d、e）。我们尝试通过在 HyPerFLEX 的 C 端添加三肽 SKL（过氧化物酶体靶向信号 1）将传感器定位于过氧化物酶体，但未成功。然而，值得注意的是，据报道过氧化物酶体导入效率较低，需要比使用靶向序列更复杂的靶向方法⁵²。总体而言，HyPerFLEX 非常适合在培养细胞的不同区室中灵敏检测过氧化氢。

图 4 HyPerFLEX 在哺乳动物细胞中的性能

a. 表达于 HeLa 细胞的 HyPerFLEX 对梯度浓度H2O2的最大响应。

b. HeLa 细胞中 HyPerFLEX 结合不同外源荧光团对 5μM H2O2的响应动力学。

c–p. 靶向不同细胞区室的 HyPerFLEX 变体荧光成像及对 10μM H2O2的响应：线粒体基质定位（c、d）、肌动蛋白微丝定位（e、f）、细胞核定位（g、h）、细胞质定位（i、j）、线粒体膜间隙定位（k、l）、内质网膜胞质侧定位（m、n）、内质网腔定位（o、p）。荧光团选用 N871b。通过 tdmito-EGFP、HyPer7-LifeAct、Hoechst 33342、EGFP-IMS、EGFP-Sec61b、EGFP-ERlum 验证传感器定位。标尺：50μm。a–p 中细胞均值归一化至基线荧光。

q. 1% 与 21% 氧气条件下，表达于 HeLa 细胞的 HyPerRed 对 100μM H2O2的响应。展示均值。

r. 1% 与 21% 氧气条件下，表达于 HeLa 细胞的 HyPerFLEX 对 100μM H2O2的响应。展示均值。所有图中标注细胞数量 n，误差线为标准差。每次成像实验为 3 次生物学重复的代表性结果。

HyPerFLEX（3a）可检测缺氧 HeLa Kyoto 细胞中的过氧化氢

荧光蛋白中发色团的成熟速率依赖于氧气，荧光传感器的寿命为几小时至几天⁵³。在长期深度缺氧条件下，由于传感器降解以及新合成的传感器无法成熟，可能导致解读错误。

HyPerFLEX 设计用于抵抗氧气限制。我们比较了 HyPerRed 和 HyPerFLEX 在 21% 和 1% 氧气条件下检测 HeLa 细胞中外源添加过氧化氢的能力。正如预期，在 1% 氧气条件下，HyPerRed 的基线荧光显著降低，对 100μM 过氧化氢的响应较弱。在常氧条件下，HyPerRed 达到传感器的最大氧化水平（图 4q）。相比之下，在不同氧气水平下，HyPerFLEX 的基线荧光或对 100μM 过氧化氢的动态范围均无变化（图 4r）。这表明 HyPerFLEX 的优势在于使用不依赖氧气成熟的外部荧光团，能够在深度缺氧或厌氧生物中准确检测过氧化氢。

在哺乳动物细胞中，HyPerFLEX 的过氧化氢灵敏度优于 HyPer7

为了比较 HyPer7 和 HyPerFLEX（3a）的灵敏度，我们在 HeLa Kyoto 细胞中共同表达了带有相同定位信号（核输出信号（NES）、核定位信号（NLS）或线粒体定位信号（mito））的两种传感器，并添加了不同浓度的过氧化氢。HyPerFLEX（3a）可检测低至 1μM 的过氧化氢（图 5a-c，紫色线），而 HyPer7 对该浓度无响应（图 5a-c，绿色线）。HyPer7-NES 和 HyPer7-mito 对 3μM 过氧化氢有响应，HyPer7-NLS 对 5μM 过氧化氢有响应。在所有细胞定位中，HyPer7 的还原动力学均慢于 HyPerFLEX。

考虑到细胞外和细胞内环境之间 100-400 倍的梯度⁴⁸，HyPerFLEX 能够检测细胞质、细胞核和线粒体基质中较低的纳摩尔浓度过氧化氢，使其灵敏度高于 HyPer7。HyPerFLEX 的灵敏度和动态范围使其能够检测过氧化氢水平的典型细胞信号变化，而非与大分子潜在损伤相关的高浓度（>100nM）¹⁷。

图 5 哺乳动物细胞中H2O2的多传感器、多参数成像

a–c. HeLa Kyoto 细胞中 HyPerFLEX 与 HyPer7 的灵敏度对比。HyPerFLEX (3a)（紫色）与 HyPer7（绿色）对梯度浓度H2O2的响应。HeLa 细胞瞬时转染细胞质（NES）、细胞核（NLS）或线粒体基质（mito）定位的传感器。展示 15 个细胞的均值 ± 标准差。

d. HeLa Kyoto 细胞不同区室的H2O2动态变化，细胞共表达线粒体定位的 HyPerRed-DAO（橙色）、HyPer7-NES（绿色）与 HyPerFLEX (3a)- 内质网腔（紫色）。D - 丙氨酸诱导线粒体产生H2O2。展示 30 个细胞的均值 ± 标准差。

e. d 实验中 HeLa 细胞的共聚焦荧光成像图。标尺：50μm。

f. g 实验中 HeLa 细胞的宽场荧光成像图。标尺：50μm。

g. HeLa Kyoto 细胞不同区室的H2O2动态变化，细胞共表达线粒体定位的 HyPerRed-DAO（橙色）、HyPer7-NES（绿色）与 HyPerFLEX (3a)- 细胞核（紫色）。D - 丙氨酸诱导线粒体产生H2O2。展示 16 个细胞的均值 ± 标准差。

h、i. 葡萄糖刺激下，小鼠 MIN6 胰岛素瘤 β 细胞线粒体基质（h）与细胞质（i）的H2O2升高。通过 jRCaMP1a（橙色）检测胰岛素分泌前的细胞质钙离子变化。展示 10 组细胞的均值 ± 标准差。每次成像实验为 3 次生物学重复的代表性结果。实验结束时添加 100μM H2O2验证 HyPer 探针功能。

线粒体基质中过氧化氢向细胞质、细胞核和内质网渗漏的可视化

HyPerFLEX 中的远红色荧光团 3a，与绿色和红色 HyPer 版本结合，可同时检测三个细胞区室中的过氧化氢。这使得我们能够研究在氧化应激模型中，线粒体基质中产生的过氧化氢是否能够到达细胞核和内质网。我们将来自酿酒酵母红酵母的 D - 氨基酸氧化酶（DAO）与 HyPerRed 融合，靶向定位于 HeLa Kyoto 细胞的线粒体基质，如前所述⁵⁴，在添加 DAO 底物（D - 丙氨酸）后，可并行产生和检测过氧化氢。

我们使用 HyPer7 监测细胞质中过氧化氢水平的变化，同时使用 HyPerFLEX（3a）-NLS 或 HyPerFLEX（3a）-ERlum 分别可视化细胞核和内质网腔中的过氧化氢。我们优化了光学配置，以分离所有传感器的荧光信号，特别是在光谱重叠的情况下。我们在表达单个传感器的细胞上进行了对照实验，以确认该设置的准确性（扩展数据图 5a）。

添加 DAO 底物 D - 丙氨酸后，HyPerRed 荧光呈剂量依赖性增加，表明线粒体产生过氧化氢（图 5d-g），内质网腔和细胞质中的传感器也检测到相应增加（图 5d，分别为紫色和绿色线），细胞核中也检测到增加（图 5g，紫色线）。尽管存在核膜屏障，但在细胞核中检测到过氧化氢的时间早于细胞质（图 5g 中 4-6 分钟），这证实了 HyPerFLEX 相比 HyPer7 具有更高的灵敏度。在较高 D - 丙氨酸浓度（500μM）下，观察到所有三个区室中过氧化氢快速增加。

这些结果与之前使用定位于细胞质、线粒体基质和膜间隙的 HyPer7 在 K562 细胞中的研究结果相反 ²⁴，在该研究中，即使在较高 D - 丙氨酸浓度下，化学遗传学产生的过氧化氢也不会从线粒体扩散到细胞质和细胞核。这些差异表明 HeLa 和 K562 细胞系线粒体的抗氧化能力存在差异。

在一项 reciprocal 实验中，将 DAO 定位于内质网腔，HyPerFLEX 定位于线粒体基质，我们发现在 D - 丙氨酸刺激内质网中过氧化氢形成后，线粒体中检测到过氧化物积累（扩展数据图 5b、c）。

葡萄糖刺激期间胰腺β 细胞中过氧化氢的检测

血糖升高会增强β 细胞中的糖酵解和氧化磷酸化，增加三磷酸腺苷（ATP）与二磷酸腺苷（ADP）的比率。这会关闭 ATP 敏感性钾（KATP）通道，使质膜去极化，并激活 L 型电压门控 Ca²⁺通道。Ca²⁺内流刺激含胰岛素颗粒的 Ca²⁺依赖性胞吐作用⁵⁵。与其他组织相比，胰腺 β 细胞的抗氧化能力较弱⁵⁶，⁵⁷，使其对活性氧（ROS）介导的信号传导敏感。研究表明，需要过氧化氢和 ATP 水平同时增加才能关闭 KATP 通道并刺激胰岛素分泌。尽管葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）过程中细胞质过氧化氢增加已得到充分证实（包括使用 HyPer（参考文献 59,60）、HyPer-3（参考文献 61）和 ROS 敏感染料的研究），但关于 GSIS 期间线粒体过氧化氢变化的数据不一致⁵⁹，⁶³。

为了解决这一问题，我们评估了葡萄糖刺激期间小鼠 MIN6 胰岛素瘤细胞线粒体和细胞质中的过氧化氢水平。细胞转染了定位于线粒体或细胞质的 HyPerFLEX，以及红色 Ca²⁺传感器 jRCaMP1a，能够同时检测过氧化氢和 Ca²⁺。使用远红色荧光团 3a 进行共聚焦成像，我们实时可视化了过氧化氢动态。共转染 MIN6 细胞的代表性共聚焦图像见补充图 5d。表达单个传感器的细胞的单色对照见补充图 5e。通过将葡萄糖浓度从 2.5mM 增加到 20mM 启动 GSIS，导致线粒体和细胞质中过氧化氢生成增加，同时细胞质 Ca²⁺升高（图 5h、i）。在相同条件下，HyPer7 在 GSIS 期间未检测到过氧化物变化（扩展数据图 5f、g），这与灵敏度比较结果一致，表明 HyPerFLEX（3a）具有更优异的检测能力。HyPer7 和 HyPerFLEX 荧光强度对 pH 变化的稳定性进一步支持了 GSIS 期间线粒体过氧化物的准确测量。总体而言，这些发现证实了 HyPerFLEX 相比 HyPer7 具有更高的灵敏度，并且能够有效检测葡萄糖诱导的胰岛素分泌过程中的过氧化氢。

HyPerFLEX-UnaG：比率型传感器变体

我们的下一个目标是创建一种适用于多光子深度成像的比率型传感器。尽管 HyPerFLEX 是一种适用于多参数成像的单波长强度型传感器，但其信号随表达水平变化，影响重现性并使样本间数据比较变得复杂。为了获得更稳定的读数，我们将 HyPerFLEX 与具有恒定荧光的荧光蛋白融合，作为表达水平的指示剂。读数为 HyPerFLEX - 荧光团复合物与荧光蛋白荧光的比率，最大限度地减少了表达水平、光漂白和激光强度变化引起的伪影。

我们比较了几种青色和绿色蛋白在多光子激发下的荧光亮度。最亮的是 UnaG—— 一种来自日本鳗鲡的 GFP⁶⁴，它仅在与胆红素结合后才发光，增强了光稳定性，并且像 HyPerFLEX 一样可在缺氧条件下使用。此外，UnaG 比 GFP 样蛋白更小。

我们测试了 UnaG 在融合蛋白中的不同位置配置和不同的柔性连接子。我们选择了将 HyPerFLEX 置于 UnaG N 端的设计，通过短连接子 “TGVDPRGS” 连接。这种排列在单光子激发下保持了 HyPerFLEX 的原始响应范围和灵敏度（扩展数据图 6a-d）。在多光子激发下，HyPerFLEX-UnaG 保持了其灵敏度和响应范围（扩展数据图 6e），而融合构建体中的 UnaG 荧光保留了其天然亮度的 90%。

使用 HyPerFLEX-UnaG 对急性脑切片神经元中过氧化氢动态进行双光子成像

HyPerFLEX 在活体动物研究中的广泛应用潜力与其双光子激发成像能力密切相关。我们评估了 HyPerFLEX 与荧光团和 UnaG 的双光子吸收（2PA）效率。红移荧光团需要 1000nm 以上的近红外辐射（HBR-3,5-DOM、N871 和 3a 的双光子吸收光谱峰值分别为 1040nm、1120nm 和 1250nm）（图 6a）。UnaG 的双光子吸收最大值在 870nm（图 6a），向高频偏移高达 3000cm⁻¹（单光子光谱见扩展数据图 6f），这可能是由于荧光蛋白中常见的振动辅助电子跃迁⁶⁵，⁶⁶。

图 6 利用HyPerFLEX-UnaG 传感器对急性脑切片中化学遗传学诱导的H2O2动态进行比率型双光子成像

a、b. UnaG（绿色）与氧化态 HyPerFLEX 结合 HBR-3,5-DOM（橙色）、N871b（红色）、3a（黑色）的归一化双光子吸收光谱（a）与发射光谱（b）。

c. 1040nm 泵浦激光下，UnaG、氧化态 HyPerFLEX 结合三种荧光团的荧光发射强度与激光功率的关系。曲线为二次函数拟合。

d. 急性脑切片 60μm 深度处，mTagBFP2-p2a-DAO-NES、氧化态 HyPerFLEX 结合 HBR-3,5-DOM 的同步多光子成像。标尺：25μm。

e、f. 表达 HyPerFLEX-UnaG 的神经元在急性脑切片中的横向（e）与纵向（f）双光子激发荧光成像。标尺：50μm。

g. 神经元中比率型组分 UnaG（绿色）与 HyPerFLEX (HBR-3,5-DOM)（红色）的双光子激发荧光延时成像。

h. 表达 HyPerFLEX-UnaG 与 DAO 的神经元（黑色）与对照脑切片（红色）的归一化荧光比值（600–650nm/500–550nm）。展示 25 个细胞的均值 ± 标准差。

i. 同一体系下 0、20、40 分钟的统计学分析。实验组（92 个细胞）与对照组（27 个细胞），3 次生物学重复。展示均值R/R0与标准差，采用双样本 t 检验 + 霍尔姆校正，图中标注 P 值。

双光子和单光子激发下的发射光谱相同，符合瓦维洛夫 - 卡沙规则（图 6b）。带有红色荧光团的 HyPerFLEX-UnaG 可使用中心波长为 900-1050nm 的单一激光源产生比率型双光子信号。一种有前景的选择是紧凑型镱离子超快激光器，可产生中心波长为 1030nm 至 1060nm 的飞秒脉冲（图 6c），也有助于同时对用于 DAO 标记的 mTagBFP2 进行三光子激发（图 6d）。

我们探索了多光子比率成像在研究急性小鼠脑切片单个神经元中过氧化氢动态的潜力。通过腺相关病毒（AAV）转导小鼠皮质神经元，使其表达 HyPerFLEX-UnaG 和细胞质过氧化氢生成器 mTagBFP2-p2a-DAO-NES。使用未表达任何遗传构建体的小鼠的对照脑切片。由于 HBR-3,5-DOM 的亮度、溶解度和适度的脑组织穿透性，我们选择其进行成像（扩展数据图 7a、b）。最大成像深度为 250μm，受荧光团通透性和非最佳激发波长下 UnaG 可视化深度限制（扩展数据图 7a）。大多数测量在 80μm 深度的 40μm 厚层内的细胞上进行（图 6e、f）。

时间序列模式下的 z 堆叠确保了目标细胞保持在视野内。我们将脑切片表面的平均泵浦功率维持在 15mW 以下，确保红色和绿色通道中的光子计数水平相同，以防止在 1 小时记录期间发生光漂白。

成像开始 5 分钟后，将荧光团注入流动系统，使 HyPerFLEX 信号加倍，而不影响 UnaG 荧光。在未表达 HyPerFLEX-UnaG 和 DAO 的对照切片中，HBR-3,5-DOM 诱导的红色背景荧光也加倍，而绿色通道背景荧光保持不变。

在表达 HyPerFLEX-UnaG 的神经元中，600-650nm 与 500-550nm 的荧光比率（对应于 HyPerFLEX（HBR-3,5-DOM）与 UnaG 的荧光比率）在荧光团注入后 10 分钟稳定（图 6g、h 和扩展数据图 7c-e）。神经元胞体和突起比添加 HBR-3,5-DOM 诱导的红色背景更红、更亮，表明传感器氧化（扩展数据图 7f）。向流动系统中添加 DAO 底物 D - 正缬氨酸，诱导表达 DAO 的细胞产生过氧化氢，导致 10 分钟内比率型 HyPerFLEX-UnaG 信号平均增加 1.5 倍（图 6g-i 和扩展数据图 7e）。在对照切片中，D - 正缬氨酸对荧光信号或比率无影响。该实验证明了使用这些传感工具对组织中过氧化氢进行非线性光学可视化的可行性。

讨论

我们通过将 HyPer7 的 cpYFP 报告结构域替换为优化的环形重排 Y-FAST，引入了 HyPer 传感器家族的新成员 HyPerFLEX。HyPerFLEX 保留了 HyPer7 的特异性和灵敏度，同时具有更广泛的应用。其光学特性由外源荧光团决定，范围从绿色到近红外，使其非常适合多参数成像，特别是因为大多数基于荧光蛋白的传感器在青色到红色范围内发射荧光。

在概念验证实验中，我们将 HyPerFLEX 与远红色荧光团 3a 结合，同时使用 HyPer7 和 HyPerRed 靶向线粒体、细胞质、细胞核或内质网。与之前的研究不同，我们检测到 DAO 在线粒体基质、细胞质和细胞核中产生的过氧化氢，这表明过氧化氢扩散依赖于细胞类型特异性抗氧化能力。这些发现与其他预测和观察到过氧化氢从线粒体流出的研究一致⁶⁷⁻⁶⁹。

此外，我们观察到在化学遗传学产生的氧化应激下，过氧化氢从线粒体流出到内质网腔—— 这是以前的 HyPer 探针无法实现的观察。这可能归因于与大肠杆菌 OxyR 相比，脑膜炎奈瑟氏球菌 OxyR 中过氧化物酶巯基的可用性及其与内质网驻留氧化还原酶的相互作用存在差异。

在 HeLa 细胞中共同表达 HyPer7 和 HyPerFLEX 允许直接比较。HyPerFLEX 对外源过氧化氢的响应浓度（1-3μM）低于 HyPer7（5μM），并且在哺乳动物细胞中，使用某些荧光团时，其响应范围高达 12-16 倍，而 HyPer7 为 10 倍。在体外，根据所用荧光团的不同，HyPerFLEX 的灵敏度与 HyPer7 相当或略低，这是因为在添加过氧化氢之前，大气氧氧化会增加背景荧光。这强调了在特定条件下对传感器进行平行测试的必要性。

HyPerFLEX 检测到了氧化应激和氧化还原信号传导事件，例如葡萄糖代谢过程中产生的过氧化氢 —— 这是胰岛素分泌⁵⁸，⁵⁹和 β 细胞增殖⁶⁰的代谢信号之一。

先前的研究⁵⁹表明，葡萄糖刺激期间 β 细胞中的过氧化氢水平低于毒性阈值，尽管线粒体过氧化氢测量结果不一致。使用定位于线粒体或细胞质且带有荧光团 3a 的 pH 稳定型 HyPerFLEX，我们观察到葡萄糖刺激的 β 细胞的细胞质和线粒体中过氧化氢水平增加。

在比较不同 pH 值细胞环境的响应数据时，必须格外谨慎。这适用于所有依赖活性半胱氨酸残基的生物传感器，包括 HyPerFLEX。pH 变化会影响去质子化活性半胱氨酸硫醇盐的浓度，从而改变化学平衡，导致特定荧光强度所需的过氧化氢浓度随 pH 值变化而变化。因此，这些传感器在每个 pH 值下都有独特的动态范围。然而，如果去质子化半胱氨酸的比例在不同细胞器的 pH 范围内保持稳定，则这种影响对荧光强度的影响将最小。此外，HyPer 传感器中的亲核半胱氨酸位于 OxyR 内的柔性动态螺旋上，纳米级局部动态足以将活性半胱氨酸稳定在硫醇盐形式⁷⁰。

HyPerFLEX-UnaG 是一种比率型变体，通过短肽连接子将 HyPerFLEX 与 UnaG 融合而成。这种杂合体保留了灵敏度和响应速率，UnaG 荧光可指示表达水平。HyPerFLEX-UnaG 中的两种荧光剂均与多光子成像兼容，能够对活脑组织中过氧化氢动态进行深度成像。主要限制是荧光团的组织通透性有限。使用薄小鼠脑切片（450μm），我们能够在 100μm 以上的深度对单个神经元进行成像。然而，多光子显微镜的光学限制（如背景信号占主导地位和有效数值孔径降低）导致图像模糊。该限制与组织的散射长度相关，散射长度会影响泵浦光子的弹道传播，在双光子显微镜中约为散射长度的五倍⁷¹，⁷²。将泵浦波长从 850nm 调整到 1040nm 或 1250nm，可将脑部成像的深度限制分别从 600μm 扩展到 800μm 和 1100μm。因此，开发更亮的红色荧光传感器和更具通透性的 HyPerFLEX 红色荧光团，可能会大大提高成像深度。

总之，HyPerFLEX 具有高灵敏度、宽响应范围、单通道读数以及基于外部荧光团的可调节光谱特性，使其成为多参数细胞成像的理想选择。其 pH 稳定性和不依赖氧气的荧光特性，使其能够在深度和长期缺氧等复杂条件下进行成像。此外，它与多光子成像兼容，尽管其在大型组织样本中的应用受到外部荧光团可用性的限制。

方法

基因克隆

HyPerFLEX 的开发

为了创建具有不同重排位置的 cpFAST 文库，我们首先生成了优化的人密码子使用的重复 Y-FAST 序列，分别使用引物对 1-2 和 3-4 在两个 Y-FAST 重复序列之间加入 5 个氨基酸和 8 个氨基酸的连接子。将所得构建体克隆到带有卡那霉素抗性的 pC1 质粒中，并用于在以下重排位置生成 FAST 的环形重排文库：36-37（引物 5-6）、59-60（引物 7-8）、61-62（引物 9-10）、65-66（引物 11-12）、73-74（引物 13-14）、99-100（引物 15-16）、100-101（引物 17-18）和 101-102（引物 19-20）。用 BamH1 和 HindIII FastDigest 限制性内切酶（赛默飞世尔科技）消化文库，并与 T4 DNA 连接酶（Evrogen）在带有氨苄青霉素抗性的 pQE-30 骨架中过夜连接。通过电穿孔将文库转化到大肠杆菌 XL-1 Blue 菌株中，并铺在具有至少 10 倍文库覆盖率的 1% LB - 琼脂平板上。用 5μM HBR-3,5-DOM 的 PBS 溶液喷洒所得菌落，并收集荧光最强的菌落。

将在两侧带有随机 1 个氨基酸连接子的最亮版本 cpFAST，使用引物 21-24 克隆到 OxyR 的 N 端和 C 端部分之间的 pQE-30 骨架中。将所得文库铺在 1% LB - 琼脂上，并在添加 200μM 过氧化氢前后，使用 ChemDoc MP 成像系统在 5μM HBR-3,5-DOM 存在下进行筛选。图像分析后，分离出对过氧化氢响应最高的菌落。

通过在荧光团结合位点附近随机化三个氨基酸（Y-FAST 命名法中的 98-100 位）（引物 25-26）并缩短重排连接子（引物 27-28），进一步优化了对过氧化氢响应最高的构建体。所有使用的引物列于补充表 1 中。对最终构建体 HyPerFLEX 进行测序，并用于进一步的体外和体内表征。

对于定位于不同细胞区室的 HyPerFLEX 版本（质粒可从 Addgene 获取），使用的定位信号如扩展数据表格 2 所述。

荧光团

在体外对 HyPerFLEX 进行表征，并将其与荧光团 HBR-3,5-DOM³⁷、N871b（参考文献 30）和 3a（参考文献 28）一起用于活细胞成像，这些荧光团由 M.S.B. 实验室按照先前发表的方案合成（补充信息）。对于细胞的寿命显微镜检查，在显微镜检查前 5-10 分钟，将荧光团添加到成像培养基中，浓度为 5μM。

细胞培养

HeLa Kyoto 细胞（人宫颈腺癌，雌性，RRID:CVCL_1922，欧洲分子生物学实验室）在添加 10% 体积分数胎牛血清（Biosera）、2mM L - 谷氨酰胺（Paneco）、100U/ml 青霉素（Paneco）和 100mg/ml 链霉素（Paneco）的 RPMI-1640 培养基（西格玛）中，在 37℃、5% 二氧化碳和 95% 空气的环境中培养。MIN6 细胞（源自胰岛素瘤的小鼠胰腺 β 细胞系，RRID:CVCL_0431；西格玛 - 奥德里奇，SCC623）在添加 4.5g/L 葡萄糖、10% 体积分数胎牛血清（Biosera）、2mM L - 谷氨酰胺（Paneco）、100μM β- 巯基乙醇、100U/ml 青霉素（Paneco）和 100mg/ml 链霉素（Paneco）的 DMEM 培养基中，在 37℃、5% 二氧化碳和 95% 空气的环境中培养。在葡萄糖刺激实验前，将细胞在添加 2.5g/L 葡萄糖和 20mM HEPES 的 HBSS 中孵育 1 小时。

转染

在实验前 2 天将细胞接种在塑料或共聚焦培养皿上，并在实验前 1 天通过每个培养皿含有 OptiMEM（吉布科）、0.3-1μg DNA 和 0.9-3μl 聚乙烯亚胺（1g/L）的混合物进行转染。DNA（μg）与转染试剂（μl）的比例为 1:3。按照制造商的方案，通过含有 2.4μl GenJect40（Molecta）、1.2μg DNA 和 100μl PBS 的混合物转染 MIN6 细胞。

缺氧处理

在实验前 1 天将 HeLa Kyoto 细胞接种在共聚焦培养皿上，并在 37℃、95% 空气和 5% 二氧化碳的环境中培养。转染当天，将细胞转移到 Whitley H45 缺氧工作站，保持培养箱内环境为 1% 氧气、5% 二氧化碳和 94% 氮气。在缺氧工作站中，将生长培养基更换为在 1% 氧气下预孵育 24 小时的低氧培养基。立即转染细胞并培养 24 小时，然后在低氧 HBSS 中进行显微镜检查。

小鼠

实验使用 6 个月大的雌性 C57Bl/6J 小鼠。小鼠以小群体（每个笼子 3-4 只）饲养在舍米亚金 - 奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所的动物设施中。小鼠饲养在环境温度为 22-24℃、光照 - 黑暗周期为 12 小时的条件下，可自由获取食物和水。所有动物实验均获得舍米亚金 - 奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所动物护理和使用委员会的批准（批准号 331）。

腺相关病毒（AAV）生产

构建了在神经元特异性 CaMKIIα 启动子（钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα 启动子）控制下携带 HyPerFLEX-UnaG 或 mTagBFP2-p2a-DAO-NES 的重组质粒（可从 Addgene 获取）。在联邦脑研究和神经技术中心的病毒核心设施中，将构建体包装到腺相关病毒 9 型颗粒中。腺相关病毒 9-CaMKIIα-HyPerFLEX-UnaG 的病毒滴度为 1.6×10¹³ 病毒基因组 /ml，腺相关病毒 9-CaMKIIα-mTagBFP2-p2a-DAO-NES 的病毒滴度为 9×10¹² 病毒基因组 /ml。

病毒载体向小鼠大脑皮质的立体定向递送

在脑内病毒注射过程中，通过吸入面罩使用 1.5% 异氟醚进行麻醉。对于局部麻醉，在切口部位皮下注射 0.25% 布比卡因（OZON 制药），总剂量低于 8mg/kg。将两种类型的病毒颗粒以 1:1 的比例混合，并使用配备 33 号钝端针头的汉密尔顿微量注射器 75RN（5μl；汉密尔顿，7634-01），将 1μl 混合物注射到大脑皮质的初级运动区。通过在颅骨上钻孔进行注射，立体定向坐标为：相对于前囟点，前后方向 2.1mm，中外侧方向 + 1.96mm，背腹侧方向 - 1.6mm（自动立体定向仪，RWD）。病毒以 50nl/min 的速率和 0.005mm/min 的插入速率注射到皮质中。取出针头前，将其留在原位 15 分钟，取出速率也为 0.005mm/min。术后通过腹腔注射酮洛芬（5mg/kg）（山德士，N013942/01）进行麻醉。

小鼠脑切片的制备

腺相关病毒注射 3 周后，在深度 3% 异氟醚麻醉下对小鼠实施断头术。迅速取出大脑，在振动切片机（VT1200S，徕卡）中，于冰冷的人工脑脊液（ACSF）中垂直切片（厚度 450μm），人工脑脊液的组成如下：124mM 氯化钠、3mM 氯化钾、1.6mM 氯化钙、1.8mM 硫酸镁、10mM 葡萄糖、1.25mM 磷酸二氢钠和 26mM 碳酸氢钠，在 pH7.4 和 34℃下用碳酸气体（95% 氧气和 5% 二氧化碳）饱和。多光子成像在流动培养箱中进行，使用室温的人工脑脊液，用碳酸气体饱和。

单光子显微镜

使用配备 SPECTRA X 光源和 Teledyne Photometrics Prime BSI 相机的尼康 ECLIPSE Ti2-E 落射荧光显微镜，或配备尼康 A1 LFOV 单色数码相机的尼康 Ti2 共聚焦显微镜进行荧光成像。使用尼康 NIS-Elements 软件进行活细胞成像。成像参数见扩展数据表格 3。

实验前，将细胞置于成像培养基（添加 20mM HEPES 和 5μM 荧光团的 HBSS）中，在 37℃、5% 二氧化碳和 95% 空气的环境中孵育 30 分钟。在显微镜检查前 5-10 分钟，将荧光团以 5μM 的浓度添加到成像培养基中。

为了确认 tdmito-HyPerFLEX 的线粒体定位，将细胞与 pCS2+-tdmito-HyPerFLEX 和 pL-CMV-tdmito-EGFP 共转染。为了确认 HyPerFLEX-LifeAct 与肌动蛋白的共定位，将细胞与 pCS2+-HyPerFLEX-LifeAct 和 pCS2+-Hyper7-LifeAct 共转染。为了分别确认 HyPerFLEX-NLS 和 HyPerFLEX-NES 的核定位或核外定位，用 2μM Hoechst 33342 对细胞核进行染色。为了确认 HyPerFLEX-IMS 在线粒体膜间隙中的定位，将细胞与 pCS2-IMS-HyPerFLEX 和 pCS2+-IMS-EGFP 共转染。为了确认 HyPerFLEX 的内质网版本的定位，将细胞分别与 pAAV-CMV-HyPerFLEX-Sec61b 或 pC1-HyPerFLEX-ERlum，以及 pAAV-CMV-EGFP-Sec61b 或 pC1-EGFP-ERlum 共转染。定位信号详情见扩展数据表格 2。将获得的双通道 16 位图像在尼康分析软件中进行处理。为通道分配伪彩色，进行去噪（可选）、线性亮度和对比度调整，并创建带有比例尺的合并图像。

使用 ImageJ 和尼康分析软件进行图像分析和编辑。来自 mito-HyperRed-DAO、HyPer7-NES 和 HyPerFlex (3a)-NLS 实验的所有多参数成像文件包含在四个通道中获取的图像：红色（HyPerRed 在 555nm 激发）、青色（HyPer7 在 395nm 激发）、绿色（HyPer7 在 470nm 激发）、紫色（HyPerFLEX (3a) 在 640nm 激发）。将 nd2 格式导入 ImageJ 时，通道被拆分。选择转染了所有三种质粒的细胞进行分析。通过视觉评估每个遗传构建体（细胞核、线粒体和细胞质）的荧光信号的正确区室化。排除荧光信号区室化不正确的细胞。使用滚动球半径为 50.0 像素的滑动抛物面项进行背景扣除。在绿色通道中，通过 HyPer7-NES 荧光使用自由手绘工具勾勒细胞轮廓。这些选择用作绿色和红色荧光通道的感兴趣区域（ROI）。在紫色通道中，勾勒出同一细胞的细胞核区域并用作感兴趣区域。测量每个通道中感兴趣区域的平均荧光值。将数字数据导出到 Origin 2015，并计算每个通道中每个感兴趣区域数据集的平均值和标准差。在某些实验中，通过除以基线荧光值对数值进行归一化，以减少由细胞中传感器表达水平不同引起的数据分散。HyPer7 比率计算为 R=FL470nm/FL395nm。

比率型双光子激发荧光显微镜

使用深度改良的直立托尔实验室多光子显微镜进行 HyPerFLEX-UnaG 的比率型双光子荧光显微镜检查，该显微镜配备超快二极管泵浦固体镱离子激光器 TEMA（Avesta 项目），可产生脉冲宽度为 150 飞秒、重复频率为 76MHz、中心波长为 1045nm 时能量高达 50nJ 的脉冲。由于 50μm 厚的 β 硼酸钡（BBO）非线性晶体中的二次谐波产生，通过自制的频率分辨光学选通装置监测脉冲持续时间。在光路中插入适当的折射望远镜，以确保水浸高数值孔径（NA）物镜 XLPLN25X-WMP2×25 1.05 NA（奥林巴斯）的光瞳填充。通过二向色镜 FF775-Di01（Semrock）和短通边缘滤光片 FF01-745/SP-25（Semrock）将荧光发射与红外泵浦辐射分离，并发送到 registration 单元。使用一对电制冷混合砷化镓磷化物光电倍增管 H7422PA-40（滨松），在 500-550nm（边缘滤光片：FELH0500 和 FESH0550，托尔实验室）和 600-650nm（边缘滤光片：FELH0600 和 FESH0650，托尔实验室）两个光谱区域同时检测 UnaG 和 HyPerFLEX 发射。在镱离子激光脉冲激发下，使用紫外级光电倍增管（PMT）H10721-210（滨松）在 450-485nm 光谱区域成像由 mTagBFP2 标记的 DAO 表达神经元的空间分布。使用热功率计 S302C（托尔实验室）在显微镜入口处测量泵浦辐射平均功率。为了使用 HyPerFLEX（HBR-3,5-DOM）监测小鼠脑切片表面下 60-100μm 深度的神经元中过氧化氢动态，泵浦辐射功率达到 20mW。在 1045nm 泵浦波长下，包括显微镜和物镜在内的光学系统的透射率约为 75%。

实验前，将脑切片置于室温的人工脑脊液中，用碳酸气体（95% 氧气和 5% 二氧化碳）灌注 30 分钟，以稳定切片结构。通过每 5 分钟记录 386×386 像素的 40μm 厚 z 堆叠（步长 2μm）来进行时间序列实验，该区域包含转导细胞。实验开始后约 5 分钟和 20 分钟，分别向灌注体积中添加 5μM HBR-3,5-DOM 和 5mM D - 正缬氨酸。完整记录持续约 60 分钟。我们进行了三组此类实验，包括来自三只小鼠和六个切片的 92 个神经元。

使用 ImageJ 进行图像分析和编辑。将获得的 z 堆叠合并为 zt 超堆叠，并在每个通道中扣除背景。使用 SIFT 算法⁷³ 校正 xy 平面中可能的图像偏移。接下来，将超堆叠拆分为 3-4 个 t 堆叠，作为来自约 15μm 厚度的最大强度投影。在 600-650nm 通道处理的情况下，首先去除来自脂褐素小滴的明亮恒定自发荧光信号。最后，找到细胞体在两个通道中荧光信号的时间依赖性，然后计算比率信号（R）。R 定义为 FL600-650nm/FL500-550nm，对应于 FL HyPerFLEX（HBR-3,5-DOM）/FL UnaG。将每个细胞（感兴趣区域）中的 R 归一化为该细胞中基线的相应平均值（R/R₀）。将这些归一化值对 n 个细胞取平均值。为了比较实验组（表达 mTagBFP2-P2A-DAO-NES 和 HyPerFLEX-UnaG 的神经元）与对照组（无转基因表达的大脑中的感兴趣区域），我们选择了荧光比率稳定的几个时间点：0 分钟时的基线信号、20 分钟时存在荧光团的信号以及 40 分钟时存在荧光团和 D - 丙氨酸的信号。在这些时间点，使用 Holm 调整的 t 检验分析归一化 R 样本（实验组 n=92，对照组 n=27）。

双光子吸收（2PA）光谱测量

使用基于专门设计的光子晶体光纤（PCF）和低功率超快钛蓝宝石（Ti:S）激光器（Avesta 项目）开发的紧凑型系统，测量荧光蛋白 UnaG 和带有红色荧光团的 HyPerFLEX 的双光子吸收光谱，该激光器产生中心波长为 840nm、能量为 4nJ 的 40 飞秒脉冲。在光子晶体光纤中形成 700nm 至 1100nm 的宽带辐射，随后从中提取光谱宽度约为 10nm 的窄带脉冲，用于对研究样本和参考样本进行双光子探测。Chebotarev 等人⁷⁴详细描述了近红外光谱区域中双光子吸收光谱测量的程序。

由于 N871b 和 3a 荧光团的预期双光子吸收光谱位于 > 1000nm 光谱范围内，使用光学参量振荡器（OPO），该振荡器带有周期性极化磷酸钛氧钾晶体，由高功率钛蓝宝石激光器 MiraHP（相干）的 120 飞秒脉冲同步泵浦，以产生 970nm 至 1550nm 范围内的可调谐超短脉冲，持续时间约为 150 飞秒。为了考虑飞秒辐射在如此宽的光谱范围内的能量、脉冲宽度和光束尺寸的变化，将获得的双光子激发荧光发射归一化为在 50μm 厚的 β 硼酸钡（BBO）晶体中产生的二次谐波信号。Lanin⁷⁵的文章详细描述了短波长红外光谱区域中双光子吸收光谱测量的程序。

通过光子晶体光纤在 700-1100nm 光谱区域或通过光学参量振荡器在 970-1350nm 光谱区域制备可调谐窄带超快脉冲后，将辐射发送到测量台，该测量台由配备高数值孔径水浸物镜 XLUMPlanFLN×20 NA 1.00（奥林巴斯）和信号 registration 系统的倒置宽场显微镜组成。根据所用荧光团的不同，通过二向色镜 DMLP650R（托尔实验室）、短通边缘滤光片 FESH650（托尔实验室）和带通滤光片 ET625/30 m 或 ET525/50 m（Chroma），将荧光发射与光子晶体光纤辐射分离。荧光发射由 H9307-02 光电倍增管（滨松）检测，随后使用锁相同步放大器（HF2LI，苏黎世仪器）进行同时放大和降噪，将其数字化。光电倍增管上的控制电压为 0.8V，斩波器频率为 1.4kHz，时间常数为 300ms。一个样本的全光谱自动记录需要约 1 分钟；扫描光谱时，窄带谱线的相邻位置之间有 600ms 的延迟。此外，还实现了使用紧凑型光纤光谱仪 Flame（Insight）记录双光子激发发射光谱。

蛋白质纯化

通过吉布森组装将 HyPerFLEX 亚克隆到 pD441-SUMO-His 载体中，并转化到 NEBTurbo（新英格兰生物实验室）表达菌株中。所有突变体通过定点突变创建（补充表 1 中的引物），并按照相同的方案纯化。将在添加 25μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中含有质粒的 NEBTurbo 细胞的过夜预培养物，以 1:200 的比例稀释到 1L 添加 25μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中，在 37℃下以 130rpm 振荡培养，直到 600nm 处的光密度（OD₆₀₀）=0.7。用 0.5mM 异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达，并在相同温度下再培养 16 小时。收集细胞，将沉淀重悬于 50mM Tris pH8.0、300mM 氯化钠、1.5mM 二硫苏糖醇（DTT）、1mg/ml 亮肽素、0.1mg/ml 4-（2 - 氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐、100mg/ml 脱氧核糖核酸酶 I 和 20mM 氯化镁中，并在 4℃下旋转孵育 30 分钟。然后通过超声破碎细胞，振幅 70%，持续 5 分钟，循环为 20 秒开启、40 秒关闭（Sonics Vibra-cell）。通过在 4℃下以 39,000×g 离心 30 分钟澄清裂解物，通过 0.45μm 滤器过滤，并与用结合缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0、300mM 氯化钠、20mM 咪唑和 1mM 二硫苏糖醇）平衡的 Ni²⁺- 琼脂糖（GE 医疗保健）亲和珠分批孵育。将裂解物 - 珠悬浮液在 4℃下旋转孵育 1 小时，随后装入 Tricorn 5 柱（思拓凡）中。后续步骤使用由 UNICORN 6.3.0.731 软件控制的 ÄKTA Pure 系统（思拓凡）进行。用结合缓冲液洗涤后，通过在十个柱体积内线性梯度洗脱至 0.5M 咪唑来洗脱蛋白质。通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析收集的级分，合并含有 HyPerFLEX 的级分，放入截留分子量（MWCO）为 10kDa 的 SnakeSkin 透析管（赛默飞世尔科技）中，并添加 His 标签化 Ulp1，重量比为 1:200。将蛋白质混合物在 50mM Tris-HCl pH8.0 和 2mM 二硫苏糖醇中，在 4℃下透析过夜，期间更换几次缓冲液。然后将 HyPerFLEX-Ulp1 混合物缓冲液交换到结合缓冲液中，并与用结合缓冲液平衡的 Ni²⁺- 琼脂糖（GE 医疗保健）亲和珠分批孵育，在 4℃下旋转 1 小时。随后将珠子装入 Tricorn 5 柱（思拓凡）中，收集流出液。使用 ÄKTA Pure 系统，通过在结合缓冲液中线性梯度洗脱至 0.5M 咪唑，洗脱 His 标签化 Ulp1、SUMO-His 和未切割的 SUMO-His 标签化蛋白质。使用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析流出液和收集的级分，合并含有切割的 HyPerFLEX 的级分，使用截留分子量为 10,000kDa 的 Vivaspin 6 PES 浓缩器（赛多利斯）浓缩，并通过使用 HiLoad Superdex200 PG（16/60）柱（GE 医疗保健）进行尺寸排阻色谱进一步纯化，该柱用 50mM Tris-HCl pH8.0、150mM 氯化钠、5mM 二硫苏糖醇和 2mM 乙二胺四乙酸（EDTA）平衡。再次使用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析级分，合并含有纯蛋白质的级分，浓缩并在液氮中快速冷冻，储存于 - 80℃。

体外测量

用 50mM 二硫苏糖醇将 HyPerFLEX 及其突变体还原 30 分钟，必要时用 10 倍摩尔过量的二酰胺氧化 10 分钟，均在室温下进行。随后使用 5ml HiTrap 脱盐柱（思拓凡），将二硫苏糖醇和二酰胺缓冲液交换到氩气冲洗的测定缓冲液（100mM 磷酸钠 pH7.4、150mM 氯化钠和 0.1mM 二乙烯三胺五乙酸（DTPA））中。使用布拉德福德测定法确定蛋白质浓度。将荧光团溶解在相同的缓冲液中。

除非另有说明，在所有测定中，1μM HyPerFLEX 与 5μM 荧光团一起使用。除预稳态动力学外，所有测定均在黑色 96 孔板（格赖纳生物一）中进行。使用由 SoftMax Pro 7.1 采集软件控制的 ID5 多功能酶标仪（Molecular Devices）记录荧光信号，设置如下：对于 HBR-3,5-DOM，激发波长 = 400-560nm，发射波长 = 600nm；对于 N871b，激发波长 = 450-580nm，发射波长 = 620nm；对于 3a，激发波长 = 450-640nm，发射波长 = 680nm。以这种方式制备的 HyPerFLEX 用于后续实验。

解离常数（KD）测定

将激发峰的荧光强度与荧光团浓度的关系图拟合到 Y=Bmax×Xʰ/（KDʰ+Xʰ），其中 Bmax 是最大特异性结合，h 是希尔系数（“具有希尔斜率的特异性结合”），使用 GraphPad Prism 9.2.0 版本。

过氧化氢滴定

通过在 240nm 处测量吸光度，分光光度法确定过氧化氢浓度。然后将激发峰的荧光强度与 log₂（过氧化氢）的关系图拟合到具有可变斜率的 S 形剂量 - 反应曲线。使用 3Sy/x/b 方法估计检测限，其中 Sy・x 是标准残差误差，b 是滴定曲线线性部分的线性回归斜率。两种拟合均使用 GraphPad Prism 9.2.0 版本进行。

pH 滴定

使用一组等离子强度的布里顿 - 罗宾逊缓冲液进行 pH 滴定，如前所述⁷⁶新鲜制备。

选择性

首先，用 25 倍摩尔过量的三（2 - 羧乙基）膦（TCEP）在 4℃下过夜处理 10μM 还原蛋白，稀释至 1μM，添加 5μM 荧光团进行测定。除非另有说明，所有化合物均在 100mM 磷酸钠 pH7.4、150mM 氯化钠和 0.1mM 二乙烯三胺五乙酸中制备，浓度为 HyPerFLEX 的 25 倍摩尔浓度。使用 ε₃₀₂nm=1670M⁻¹cm⁻¹，分光光度法确定过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）储备液的浓度。然后在将黄嘌呤 / 黄嘌呤氧化酶、次氯酸（ClO⁻）和过氧亚硝酸盐样品添加到 HyPerFLEX 之前，向其中添加 1μM 过氧化氢酶，并在 25℃下孵育 5 分钟。特异性测定中使用的所有化学品均购自西格玛 - 奥德里奇，除了过氧亚硝酸盐（凯曼化学）和二硫化谷胱甘肽（GSSG）（罗氏）。

预稳态动力学

使用配备荧光检测器的停流装置进行预稳态动力学测量，该检测器由 Bio-Kine32 软件（Bio-Logic）控制，对于 HBR-3,5-DOM，激发波长 = 516nm，对于 N871b，激发波长 = 560nm，分别使用 550nm 和 600nm 截止滤光片检测发射。将还原的 HyPerFLEX 与过氧化氢以 1:1 的比例混合，最终浓度为 1μM HyPerFLEX 和 5μM 荧光团。所用过氧化氢浓度确保准一级反应条件（即 HyPerFLEX 和过氧化氢浓度之间至少相差 10 倍）。

将每个过氧化氢浓度下原始 HyPerFLEX 的获得轨迹拟合到双相结合模型（Y=Y₀+SpanFast×(1-exp (-KFast×X))+SpanSlow×(1-exp (-KSslow×X))，其中 SpanFast=(平台期 - Y₀)×PercentFast×0.01，SpanSlow=(平台期 - Y₀)×(100-PercentFast)×0.01），将半胱氨酸突变体的轨迹拟合到单相结合模型（Y=Y₀+(平台期 - Y₀)×(1-exp (-K×X))），使用 GraphPad Prism 9.2.0 版本。通过评估残差与 X 的关系图进行拟合诊断。然后通过线性回归，使用从模型中获得的 k 或 kfast 值确定二级速率常数。

寡聚状态测定

通过分析型尺寸排阻色谱，使用 Superdex75 10/300 柱（思拓凡），在 100mM 磷酸钠 pH7.4、150mM 氯化钠和 0.1mM 二乙烯三胺五乙酸中平衡，并通过在 280nm 处跟踪吸光度，确定寡聚状态。然后注入 1mg/ml HyPerFLEX。对于还原样品，将 HyPerFLEX 与 5mM 二硫苏糖醇混合。为了氧化 HyPerFLEX，用等摩尔量的过氧化氢处理它。在每种情况下，使用 5 倍摩尔过量的荧光团。根据由商业凝胶过滤标准品（伯乐，1511901）制作的标准曲线，从保留体积估计流体动力学半径。

荧光光谱

如前所述还原的 50μM HyPerFLEX，在 4℃下用 25 倍摩尔过量的三（2 - 羧乙基）膦过夜进一步还原。使用 Cary Eclipse 荧光分光光度计（安捷伦），在 1cm 石英比色皿中记录光谱。还原态和氧化态 HyPerFLEX 的使用浓度均为 5μM，每种荧光团的使用浓度均为 25μM。光谱记录设置如下：对于 HBR-3,5-DOM，激发波长 = 400-580nm，发射波长 = 592nm；对于 N871b，激发波长 = 400-590nm，发射波长 = 602nm；对于 3a，激发波长 = 450-660nm，发射波长 = 672nm。

荧光量子产率测定

使用 FAST 与相应荧光团的复合物作为标准品，确定氧化态和还原态 HyPerFLEX 与 HBR-3,5-DOM、N871b 和 3a 的复合物的荧光量子产率。分析的混合物含有 2μM 蛋白质、20μM 荧光团，还原的 HyPerFLEX 样品中含有 0.4mM 三（2 - 羧乙基）膦，氧化的 HyPerFLEX 样品中含有 2mM 过氧化氢。量子产率计算如下：

Φₓ=Φₛₜ×Fₓ/Fₛₜ×fₛₜ/fₓ×nₓ²/nₛₜ²

其中 F 是发射峰下的面积，n 是溶剂的折射率，Φ 是量子产率，下标 x 对应于 HyPerFLEX - 荧光团复合物，下标 st 表示标准品。吸收因子 f 计算如下：

f=1-10⁻ᴬ (2)

其中 A 是激发波长下的吸光度。标准品的量子产率取自 Myasnyanko 等人 ²⁸的研究。

解离常数（pKa）测定

如前所述⁷⁷估计 pKa。简而言之，通过在室温下用 50mM 二硫苏糖醇处理 30 分钟制备还原的 HyPerFLEX，同时在室温下用 10 倍摩尔过量的二酰胺处理 10 分钟制备氧化样品，作为参考。然后使用 PD SpinTrap G-25 柱（思拓凡），将还原和氧化样品缓冲液交换到含有 10mM 柠檬酸钠、硼酸盐和磷酸盐的多缓冲溶液中，pH 范围为 6-9（用盐酸或氢氧化钠调节）。使用 DTNB 测定法验证脱盐蛋白质的氧化还原状态。在生物分光光度计（艾本德）上记录 240nm 和 280nm 处的吸光度。将归一化吸光度（A₂₄₀/A₂₈₀）与 pH 的关系图拟合到亨德森 - 哈塞尔巴尔赫方程，使用 GraphPad Prism 9.2.0 版本推导 pKa。

HyPerFLEX 结构的 AlphaFold2 预测

使用由 ColabFold 支持的 AlphaFold2-multimer 进行结构预测。用于运行结构预测过程的脚本如下：colabfold_batch–model-type AlphaFold2-multimer-v3–num-recycle 48–amber–use-gpu-relax⁷⁸。AlphaFold2-multimer-v3 是 AlphaFold2 模型的专用版本，专为管理蛋白质复合物或多聚体设计。在预测过程中，使用 48 个循环步骤，作为模型微调其预测以提高准确性的迭代过程。优化阶段使用 AMBER—— 一种常用于分子动力学模拟的力场。此外，实施了优化过程，进一步优化预测结构，以获得更真实和能量有利的构象。使用 PyMol 3.1.3 软件（https://pymol.org）进行可视化。

用于预测结构验证的突变体筛选

将所有突变体转化到 NEBTurbo（新英格兰生物实验室）表达菌株中。将在添加 25μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中含有质粒的 NEBTurbo 细胞的过夜预培养物，以 1:200 的比例稀释到添加 25μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中，在 37℃下以 130rpm 振荡培养，直到 OD₆₀₀=0.7。然后用 0.5mM 异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷诱导蛋白质表达，并在相同温度下再培养 16 小时。测量 OD₆₀₀，将足够的细胞沉淀在黑色微孔板（格赖纳）的每个孔中，使 OD₆₀₀=1，在 1700g 下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 PBS 中。然后向每个孔中添加 10μM HBR-3,5-DOM，并使用 ID5 酶标仪（Molecular Devices），在激发波长 = 510nm、发射波长 = 600nm 下测量荧光信号强度。九次循环后，向每个孔中添加 100μM 过氧化氢或 PBS（载体），并跟踪响应 2 小时。使用未添加荧光团的细胞的荧光信号强度减去背景。实验一式三份进行。

圆二色谱（CD）

对于还原样品，在室温下用 50mM 二硫苏糖醇预还原 HyPerFLEX 30 分钟。对于氧化样品，在室温下用 10 倍摩尔过量的二酰胺氧化 HyPerFLEX 10 分钟。然后使用 5ml HiTrap 脱盐柱（思拓凡），将二硫苏糖醇和二酰胺缓冲液交换到氩气冲洗的圆二色谱缓冲液（50mM 磷酸钠和 200mM 氟化钠）中。使用布拉德福德测定法确定浓度，并制备 0.5mg/ml 的浓度。还原样品额外用 5mM 二硫苏糖醇处理。含有 5mM 二硫苏糖醇的圆二色谱缓冲液用作还原样品的背景对照，不含二硫苏糖醇的圆二色谱缓冲液用作氧化样品的背景对照。使用由 Bio-Kine32 软件（Biologics）控制的 MOS500 圆二色谱仪，在 1mm 石英比色皿中，在 185nm 至 280nm 范围内进行测量。

蛋白质印迹法

将表达 HyPerFLEX（OD₆₀₀=20）的细胞在 1700g 下离心 5 分钟沉淀，在添加 100mg/ml 脱氧核糖核酸酶 I、1mg/ml 亮肽素、0.1mg/ml 4-（2 - 氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐和蛋白质抑制剂混合物（罗氏）的 B-Per 中裂解，在室温下振荡 15 分钟。随后通过在 15,000g 下离心 5 分钟澄清裂解物。使用布拉德福德测定法量化裂解物中的蛋白质含量，并在 4-20% 梯度 Mini PROTEAN TGX 凝胶（伯乐）上分析 30μg 蛋白质。然后使用 Trans-Blot Turbo 转移包（伯乐），在 2.5A 和 25V 下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上 3 分钟。将膜用 5% 牛奶在室温下封闭 1 小时，然后在 4℃下与抗 HyPer7 兔多克隆抗体（定制，金斯瑞；稀释比例 1:1,000）孵育过夜。用含吐温 20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）洗涤印迹三次，每次 10 分钟，然后在室温下与抗兔二抗（EMD 密理博，12-348；稀释比例 1:5,000）孵育 1 小时。再次用含吐温 20 的 Tris 缓冲盐水洗涤印迹五次，每次 5 分钟。使用 Pierce 增强化学发光蛋白质印迹底物（赛默飞世尔科技），通过 Amersham ImageQuant800（思拓凡）成像系统可视化膜。

UnaG 光谱研究

带有 6×His 标签的 UnaG 蛋白在大肠杆菌 XL-1 Blue 菌株中表达，并在 TALON 金属亲和树脂（克隆泰克）上纯化。为了获得全蛋白，向 15μM UnaG 的 PBS 溶液中添加 30μM 胆红素，然后在截留分子量为 10kDa 的 Amicon Ultra 滤器上冲洗掉游离胆红素⁶⁴。

统计分析

特定实验的样本量、重复次数、量化方法、数据点排除原因等在相应的方法部分或图注中描述。没有使用统计方法预先确定样本量，但我们的样本量与先前发表的研究²⁴，⁷⁹中报告的样本量相似。数据收集和分析并非在对实验条件不知情的情况下进行。

数据可用性

本文未报告原始代码。数据可应通讯作者的要求获取。源数据与本文一起提供。

致谢

本研究由俄罗斯科学基金会（RSF）资助，资助号 23-75-30023（V.V.B.、D.I.B.、E.S.P. 和 D.I.M.）。病毒基因递送系统的优化和生产得到精准基因组编辑与生物医学遗传技术中心的支持（V.V.B. 资助号 075-15-2019-1789，授予皮罗戈夫俄罗斯国家研究医科大学）。多光子成像方法的开发得到俄罗斯科学基金会资助号 22-72-10044（A.S.C. 和 A.A.L.）、莫斯科国立大学发展计划和国家项目 “科学与大学”（A.A.L. 和 A.B.F.）的支持。J.M. 得到 VIB 资助。

作者贡献

D.D.F.、V.A.S. 和 V.V.P. 设计并突变了 cpFAST 和 HyPerFLEX 蛋白，并进行了初步的 HyPerFLEX 体外表征。E.S.P. 和 D.I.B. 设计了细胞研究，创建并测试了细胞定位的 HyPerFLEX 版本，进行了缺氧实验和多参数细胞成像，并分析了成像数据。J.M. 和 D.E. 设计并进行了纯化 HyPerFLEX 的体外实验（pH 依赖性、灵敏度和特异性），表征了反应的动力学参数，研究了过氧化氢介导的氧化机制，并使用 AlphaFold2 进行了结构预测。M.S.B.、I.N.M. 和 A.I.S. 合成了荧光团。A.S.C.、A.B.F.、A.M.Z. 和 A.A.L. 进行了双光子成像并分析了数据。A.A.M. 进行了慢病毒生产。E.S.P. 和 D.I.M. 进行了小鼠实验。V.V.B. 指导了该研究。E.S.P.、D.I.B.、J.M.、D.E.、D.D.F.、A.A.L. 和 V.V.B. 撰写了本文。

利益冲突

E.S.P.、D.I.B. 和 V.V.B. 作为发明人，已根据俄罗斯联邦管辖范围，就 HyPerFLEX 传感器的核苷酸和氨基酸序列的使用提交了专利申请（专利申请号 2024111459）。其他作者声明无利益冲突。

补充信息

扩展数据可在本文的https://doi.org/10.1038/s41589-025-02036-6获取。

扩展数据注释

扩展数据图 1 HyPerFLEX 的设计与优化

颜色标注：脑膜炎奈瑟菌 OxyR（蓝色）、环化重排 FAST（灰色）、接头（粉色）、环化重排接头（GTGG）、氨基酸 98-100（TLT，橙色）。

扩展数据图 2 HyPerFLEX 与纳摩尔级低浓度H2O2反应

a. HyPerFLEX 的H2O2滴定曲线。信号强度为激发最大值，归一化至无H2O2组，以H2O2浓度的对数为横坐标绘图。数据拟合 S 型剂量 - 响应曲线，虚线为 95% 置信区间，标注拟合优度R2。

b. 用于估算检测限的滴定曲线线性区间。数据为至少 3 次实验均值，误差线为标准误，虚线为 95% 置信区间。三种荧光团下检测限分别为：HBR-3,5-DOM≈21nM，N871b≈30nM，3a≈8nM。

扩展数据图 3 HyPerFLEX 的H2O2响应动力学依赖 Cys121 质子化状态，Phe130 为功能必需

a. 尺寸排阻色谱证实 HyPerFLEX 为二聚体。展示洗脱曲线与校准曲线，红色点为 HyPerFLEX。

b. 无论氧化还原状态，所有荧光团与 HyPerFLEX 的结合KD均为微摩尔级。激发峰强度归一化至最大 / 最小值，数据拟合 “特异性结合 + 希尔系数” 模型，展示KD与希尔系数 h，均值 ± 标准误，n≥3，虚线为 95% 置信区间。

c. HyPerFLEX 及其突变体的抗 HyPer7 免疫印迹，及转印后丽春红染色。

d. F130A 突变不影响 HyPerFLEX 二级结构与氧化后的构象变化。展示野生型与 F130A 突变体还原 / 氧化态的圆二色谱，n=3。

e. F130A 突变体与野生型 HyPerFLEX 对 HBR-3,5-DOM 的KD相近。数据拟合 “特异性结合 + 希尔系数” 模型，均值 ± 标准误，n=2，虚线为 95% 置信区间。

f. HyPerFLEX 与H2O2反应曲线拟合单 / 双指数模型的残差图。

g. HyPerFLEX C261S 突变体在 10 倍过量H2O2下的kobs与H2O2浓度关系，均值 ± 标准误，n=3。

h. HyPerFLEX C261S 突变体在低摩尔过量H2O2下反应曲线拟合单指数模型的残差图。

扩展数据图 4 HyPerFLEX 在哺乳动物细胞中的性能

a–c. HeLa 细胞中 HyPerFLEX 结合 HBR-3,5-DOM（a）、N871b（b）、3a（c）对梯度外源H2O2的响应动力学。

d–f. 高氧化区室中 HyPerFLEX 变体的响应动力学：线粒体膜间隙（d）、内质网膜胞质侧（e）、内质网腔（f），荧光团选用 N871b。所有图中细胞均值归一化至基线荧光，误差线为标准差，标注细胞数量 n。

扩展数据图 5 哺乳动物细胞中H2O2的多传感器、多参数成像

a. HyPerRed-DAO、HyPerFLEX (3a)、HyPer7 共表达实验的单色对照。HeLa Kyoto 细胞表达单一传感器，采用相同光学参数成像，展示 10 个细胞的均值 ± 标准差。

b. 共表达 HyPerRedDAO - 内质网腔与 HyPerFLEX (3a)- 内质网腔的 HeLa Kyoto 细胞共聚焦荧光成像。标尺：50μm。右图为 HyPerFLEX (3a)- 内质网腔对 D - 丙氨酸诱导的H2O2检测。

c. 共表达 HyPerRed-DAO - 内质网腔、HyPerFLEX (3a)- 线粒体、HyPer7-NES 的 HeLa Kyoto 细胞荧光成像。标尺：50μm。展示不同区室H2O2动态，浅绿 / 浅紫为单个细胞，深线为均值，D - 丙氨酸诱导内质网腔产生H2O2，15–18 个细胞均值。

d. 共表达 jRCaMP1a 与线粒体 / 细胞质 HyPerFLEX (3a) 的 MIN6 细胞共聚焦荧光成像。标尺：50μm。

e. HyPerFLEX (3a) 与 jRCaMP1a 共表达实验的单色对照。MIN6 细胞表达单一传感器，采用相同光学参数成像，展示 11 个（红色荧光）、14 个（远红荧光）细胞的均值 ± 标准差。

f、g. 葡萄糖刺激下胰腺 β 细胞线粒体与细胞质的H2O2检测。HyPerFLEX (3a) 检测到H2O2升高，HyPer7 无响应，jRCaMP1a 检测钙离子变化，15 个细胞均值 ± 标准差。所有成像实验为 3 次生物学重复的代表性结果，实验结束添加 100μM H2O2验证探针功能。

扩展数据图 6 假比率型 HyPerFLEX 变体的设计与表征

a. 三光子激发（1250nm）下不同荧光蛋白的亮度。

b. HeLa 细胞中 HyPerFLEX-UnaG 融合蛋白与原始 HyPerFLEX 的荧光动力学，添加 7.5μM H2O2，n=40–50。

c. HyPerFLEX-UnaG 结合 N871b 对梯度H2O2的荧光比值动力学，n=40–60。

d. HyPerFLEX-UnaG 对梯度H2O2的最大响应，均值归一化至基线，n=40–60。

e. 多光子激发下 HyPerFLEX-UnaG 与原始 HyPerFLEX（3a）对 100μM H2O2的荧光动力学，n=20–40。

f. 全蛋白 UnaG 的吸收、荧光激发与发射光谱。b–e 中细胞均值归一化至基线，误差线为标准差，标注 n。

扩展数据图 7 利用 HyPerFLEX-UnaG 对急性脑切片中化学遗传学诱导的H2O2动态进行比率型双光子成像

a. 神经元离体双光子激发荧光比率成像。脑切片表面下 50、100、150、200、250μm 深度，添加荧光团与 D - 正缬氨酸后 UnaG（绿色）与 HyPerFLEX-HBR3,5-DOM（红色）成像。

b. 双光子激发荧光信号随组织深度的变化，橙色三角为 HyPerFLEX，红色圆圈为 N871b，青色方框为 UnaG，灰色线为散射导致的指数衰减。

c. 传感器假比率信号的强度动力学。

d. 对照脑切片中 HyPerFLEX/UnaG 荧光比值。

e. 神经元中 HyPerFLEX/UnaG 荧光比值。

f. 双光子激发荧光成像。添加 HBR-3,5-DOM 前后 UnaG 与 HyPerFLEX 通道的代表性图像。所有图像与数据为典型实验结果。

扩展数据表格

扩展数据表 1 | HyPerFLEX 结合不同荧光团的还原 / 氧化态光学特性

扩展数据表 2 | HyPerFLEX 所用细胞定位信号

·细胞核输出：HIV-1 Rev 激活结构域

·线粒体基质：未标注具体序列

·肌动蛋白微丝：LifeAct 肽，5 个氨基酸接头连接至 HyPerFLEX C 端

·线粒体膜间隙：Smac/DIABLO 蛋白 1-59 位氨基酸，肽接头连接至 HyPerFLEX N 端

·内质网：Sec61b 定位序列 + C 端 KDEL 内质网滞留信号

扩展数据表 3 | 单光子荧光显微成像参数

包含荧光团、激发光源、滤光片、物镜、延时成像帧率等全部成像参数，覆盖H2O2动态检测、传感器定位、钙离子动态检测等所有实验场景。