非洲爪蟾肢体再生

利用新型非洲爪蟾外周蛋白报告品系可视化发育与再生肢体中的外周神经

Miyuki Suzuki, Yosuke Kato, Rima Mizuno, Hiroshi Yajima, Shinichirou Miura, Tetsuya Endo,

Makoto Mochii*, Ken-ichi T. Suzuki*

摘要

外周蛋白（PRPH）是一种 Ⅲ 型中间丝蛋白，在外周神经中表达，并在轴突生长与再生过程中上调。本研究构建了一株转基因非洲爪蟾（Xenopus laevis）品系，可用于外周神经系统的长期在体可视化观测。通过缺失与基序分析，我们鉴定出非洲爪蟾prph基因启动子与 1 号内含子中对神经元表达至关重要的顺式调控区域。稳定品系在胚胎发育中的神经原基和蝌蚪的外周神经中呈现出强烈的 EGFP 报告基因活性。转基因蝌蚪可实现肢体发育全过程中外周神经的在体成像。在幼体肢体再生过程中，我们观察到神经早期适度进入芽基，重现了早期肢体发育中的神经分布模式。与之相反，变态后肢体芽基在再生早期即呈现出广泛的神经支配。此外，成体前肢再生神经中报告基因活性的增强，提示再生相关的外周神经支配调控及其在芽基形成中的潜在作用。该转基因品系将成为分析发育、变态与再生过程中大规模神经重塑的多功能工具。

1引言

外周蛋白（Peripherin，PRPH）是一种 Ⅲ 型中间丝蛋白（Portier et al., 1983），表达于外周神经系统（PNS），尤其在感觉神经元与自主神经元中（Brody et al., 1989; Escurat et al., 1990; Yuan et al., 2012）。PRPH 在脊椎动物中高度保守，包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类与鱼类。在非洲爪蟾中，prph基因（亦称XIF3）广泛表达于外周神经系统与中枢神经系统（CNS）结构，包括神经板原基、嗅基板、神经胚期的颅神经节，以及尾芽期的脑与脊髓（Green and Vetter, 2011; Sharpe et al., 1989）。已知大鼠Prph与人PRPH的表达在神经发育的轴突生长阶段上调（Escurat et al., 1990; Xiao et al., 2006），提示其在轴突生长中具有重要作用。在大鼠 PC12 细胞中，Prph的表达在神经生长因子（NGF）诱导的神经元分化过程中特异性升高（Aletta et al., 1989; Leonard et al., 1988）。在非洲爪蟾胚胎脊髓分散培养体系中，Prph 在未成熟的神经突起分支中活跃表达（Smith et al., 2006; Undamatla and Szaro, 2001）。PRPH 在轴突再生过程中的上调也已被广泛证实，受损的外周神经元其表达量显著升高；轴突延伸完成后表达下调，支持其在轴突再生中的潜在作用（Oblinger et al., 1989; C.M. Troy et al., 1990; Wong and Oblinger, 1990）。此外，PRPH 与多发性神经病、创伤性神经损伤、糖尿病性神经病变相关，近年来作为外周神经系统神经损伤的潜在生物标志物受到关注（Hol and Capetanaki, 2017; Keddie et al., 2023; Manco et al., 2025; Romano et al., 2022）。

包括非洲爪蟾在内的无尾两栖类，幼体阶段可在形态与功能上再生多种器官，如肢体、尾部与部分脑组织（Beck et al., 2009; Dent, 1962; Yoshino and Tochinai, 2006）。然而，非洲爪蟾在从幼体到成体的变态过程中发生剧烈的组织重塑，并丧失再生能力。蝌蚪可实现无瘢痕愈合与组织再生，而成体阶段这些能力显著下降（Phipps et al., 2020）。具体而言，蝌蚪在变态前阶段（50–52 期）可完全再生后肢，后期再生趾的数量减少，变态后幼蛙仅能形成形态异常的软骨棘突（Dent, 1962; Endo et al., 2004; Keenan and Beck, 2016; Tassava, 2004）。在终身保持强大再生能力的有尾两栖类（蝾螈）中，神经在肢体再生中发挥关键作用；去神经支配会导致再生完全失败，有研究认为神经源性营养因子支持芽基细胞的存活与增殖（Kumar and Brockes, 2012; Pirotte et al., 2016; Stocum, 2017）。因此，详细解析神经支配对于理解非洲爪蟾的肢体再生同样必要。

为对变态、再生等胚后过程进行连续在体分析，可视化神经的转基因非洲爪蟾品系必将成为外周神经系统与器官再生研究的核心、多功能资源。目前用于神经元可视化的转基因蛙多采用Ⅱ 类 β- 微管蛋白（tubb2b）启动子驱动报告基因，几乎可标记中枢神经系统的所有神经元群（Horb et al., 2019; Love et al., 2011）。在tubb2b::GFP 转基因非洲爪蟾品系中，可观察到大量 GFP 阳性神经元分布于幼蛙的再生芽基中（Suzuki et al., 2006）。但有研究报道tubb2b转基因品系无法标记前脑中的部分神经元（Daume et al., 2022），提示需要拓展以外周神经系统（尤其是神经嵴来源的背根神经节dorsal rootganglion， DRG）为靶点的神经元报告工具。

本研究旨在构建一株可在体成像外周神经系统（尤其是 DRG 神经元）的转基因非洲爪蟾品系。通过对增强子与启动子进行系列缺失分析，我们缩小了prph基因神经元特异性转录的必需区域。随后，我们建立了由prph启动子与 1 号内含子驱动 EGFP 表达的稳定转基因品系，该品系在胚胎发生期的神经板与幼体阶段的外周神经系统中均呈现强报告基因表达。利用该品系，我们对变态前与变态后阶段肢体发育与再生过程中的外周神经支配模式进行成像，揭示了幼体与成体阶段截然不同的神经支配模式。综上，本研究证实prph是外周神经系统在体研究的优质标记基因，尤其适用于神经再生与变态过程的探究。

2结果

2.1 prph:EGFP 转基因品系的构建

既往小鼠研究表明，1 号内含子是大鼠Prph细胞类型特异性表达所必需，但对损伤信号无响应（Uveges et al., 2002）。利用 VISTA 序列比对工具对非洲爪蟾X. laevis（prph.L）与热带爪蟾X. tropicalis的prph基因的 4.7 kb 1 号内含子进行比较序列分析，鉴定出四个高度保守区域（图 1A）。prph.S中也存在相似的保守区域（数据未显示）。据此，我们从基因组文库中分离出全长 1 号内含子与包含prph.L 5' 非翻译区的 914 bp 启动子区域，构建转基因载体（图 1B）。转基因 EGFP（prph:EGFP）荧光首先在神经胚期的神经原基、嗅基板与颅神经节中被检测到（图 1C）。尾芽期，中枢神经系统（包括脑与脊髓）中观察到强烈荧光。全胚原位杂交（WISH）检测到的内源性prph mRNA 表达区域与 EGFP 报告基因模式一致，与既往报道相符（Green and Vetter, 2011; Sharpe et al., 1989）。在转基因蝌蚪中，不仅中枢神经系统，外周神经系统衍生结构（如视神经、三叉神经）也呈现出强烈的 EGFP 荧光（图 1D）。

2.2 prph.L 1 号内含子增强子的系列缺失分析

为进一步解析爪蟾prph基因中包含四个保守区域的 1 号内含子增强子，我们对增强子进行系列缺失分析（图 2A）。全长 1 号内含子与 CMV 最小启动子组合可在尾芽期中枢神经系统中特异性、高强度表达 EGFP。逐段删除保守区域的缺失分析显示，区域 Ⅱ 是转基因胚胎中神经细胞特异性增强子活性所必需。所有测试的缺失构建体总结于图 S1。为探究外周神经元中prph激活的调控机制，我们利用 Xenbase 数据库中公开的神经胚期热带爪蟾prph基因 ATAC-seq 数据（Fisher et al., 2023），分析了染色质可及性。ATAC-seq 峰显示，在prph表达的神经胚期，启动子区域与 1 号内含子的同源区域 Ⅱ 处存在染色质可及峰（图 2B）。利用 JASPAR 对这些区域进行基序分析，鉴定出高迁移率族（HMG）与同源异型框类型顺式元件位于 ATAC-seq 峰附近（图 2B，图 S2）。

2.3 蝌蚪外周神经的在体可视化

我们构建了prph:EGFP 转基因品系，可在非洲爪蟾整个发育过程中在体可视化中枢与外周神经系统。孵化后（45 期），F1 代蝌蚪的报告基因表达可清晰在中枢与外周神经系统中检测到，包括脊髓与背根神经节（DRG）（图 3A 箭头）。组织切片免疫组化进一步证实 EGFP 在后脑、脊髓与脊神经中表达。报告蛋白特异性出现在胚胎与变态前阶段的室管膜层（VL）、脊髓、DRG 及各类神经元中（补充图 3 的 42 期与图 3B 的 52 期）。双重免疫染色显示 EGFP 与乙酰化微管蛋白（AcTub）在 DRG 中共定位，证实该转基因品系可忠实地反映中枢与外周神经系统的神经元分布。在外周神经系统中，EGFP 信号沿外周神经遍布全身（图 3C），可对活体蝌蚪的神经支配进行连续在体观测。

2.4 肢体发育与再生过程中的神经支配

利用prph:EGFP 报告品系，我们对蝌蚪肢体发育与再生过程中的外周神经支配进行时序分析。从 51 期到 55 期后肢发育的连续 EGFP 成像显示，外周神经从躯干 DRG 向肢芽延伸（图 4A）。肢芽萌发初期仅有少量神经进入；随着形态建成推进，远端发育中的肢板出现广泛的神经支配与分支。

随后我们观察肢体再生过程中的外周神经支配。非洲爪蟾蝌蚪具有强大的再生能力，变态前阶段可完全再生截肢后的后肢；而变态后幼蛙无法完成再生，仅形成棘突结构。幼体后肢再生中（图 4B），截肢后 4 天（dpa）的早期芽基神经支配极为稀疏。随着形态建成推进，外周神经生长与分支重现了早期肢芽发育的模式。与之相反，幼蛙肢体再生的连续成像显示，再生芽基形成阶段即有大量外周神经长入芽基间充质（图 5A）。芽基切片免疫染色中 EGFP 与轴突标记物乙酰化微管蛋白的共定位证实了这种显著的神经支配（图 5B）。此外，我们观察到再生前肢神经中的 EGFP 荧光持续强于同一动物的完整（未截肢）前肢（图 6A）。这种差异在双侧离体前肢神经中同样明显（图 6B），平均荧光强度定量分析证实再生侧显著升高（p<0.01，n=10；图 6C）。小鼠 PRPH 主要在胞体合成，并以顺行方式运输至外周神经（Xia et al., 2003）。与此一致，神经中增强的 EGFP 信号可能反映了非洲爪蟾肢体再生过程中 DRG 内prph启动子 / 增强子的激活。因此，这些结果提示外周神经中prph的再生相关激活，可能受 DRG 中转录变化的调控。

3讨论

外周蛋白（PRPH）是表达于外周神经系统的 Ⅲ 型中间丝蛋白，在轴突发育与再生过程中发挥关键作用。本研究构建了稳定的非洲爪蟾报告品系，可特异性标记外周神经系统，实现发育与再生过程中外周神经的在体可视化。已知PRPH基因可响应神经损伤（Oblinger et al., 1989; C.M. Troy et al., 1990; Wong and Oblinger, 1990），并因其在神经病变等神经损伤中的潜在作用受到关注（Keddie et al., 2023; Romano et al., 2022）。我们证实肢体再生过程中芽基受到广泛的外周神经支配，且体内prph启动子 / 增强子被强烈激活。本研究结果凸显非洲爪蟾prph作为优质标记基因，可推动外周神经在早期发育、变态与再生中的研究。

3.1 发育过程中prph的转录调控

报告基因分析显示，4.7 kb 的 1 号内含子对于从早期发育到变态后各阶段中枢与外周神经系统的精准表达至关重要。尤为重要的是，我们发现 1 号内含子的区域 Ⅱ 是prph神经元特异性表达所必需。在转基因小鼠报告研究中，同样有报道称 1 号内含子是大鼠Prph在 DRG、肠神经系统与运动神经元中细胞类型特异性表达所必需（Uveges et al., 2002）。结合既往研究，本发现表明PRPH 1 号内含子的细胞类型特异性在脊椎动物中演化保守。基于 ATAC-seq 数据与 JASPAR 的进一步分析显示，神经胚期启动子区域与 1 号内含子区域 Ⅱ 存在特异性染色质可及峰，包含推定的 HMG 与同源异型框基序。哺乳动物PRPH基因不仅在分化的外周神经系统中高表达，也在早期脊椎动物胚胎的神经原基中表达，凸显其在早期哺乳动物神经发生中的重要性。人PRPH启动子中已鉴定出神经嵴相关转录因子 AP-2（TFAP2）基序（Foley et al., 1994; C.M. Troy et al., 1990）。启动子与 1 号内含子区域 Ⅱ 中存在 HMG 结合基序，提示非洲爪蟾prph表达可能受神经嵴调控因子Sox10调控。尽管ebf3可能直接调控非洲爪蟾prph（Green and Vetter, 2011），但在所分析区域中未检测到 EBF 家族结合基序。

3.2 幼体与成体肢体再生中外周神经支配的差异

prph:EGFP 品系实现了肢体发育与再生的在体成像，揭示了幼体与成体截然不同的外周神经支配模式。蝌蚪肢芽发育早期神经支配极少，随形态建成逐步增加；再生过程遵循相似模式。与之相反，成体再生在芽基形成阶段即出现广泛神经支配，可能支持芽基生长。神经与神经源性因子在肢体再生中的重要性已被广泛证实（Kumar and Brockes, 2012; Pirotte et al., 2016; Stocum, 2017）。辅助肢体模型（accessory limb model，ALM）进一步证明这一点：将神经引导至皮肤伤口可产生异位芽基，提示神经存在是芽基形成的必要条件（Endo et al., 2004）。此外，增加神经支配可改善非洲爪蟾的肢体再生能力，形成分叉或多重骨骼结构而非简单棘突（Kawasumi-Kita et al., 2024; Kurabuchi, 1992; Mitogawa et al., 2018）。非洲爪蟾幼蛙的芽基形成过程存在神经依赖与非依赖事件。间充质标记基因prx1的再激活在肢体再生起始阶段以神经非依赖方式发生，但神经是芽基生长（包括细胞增殖、存活与fgf8上调）所必需（Suzuki et al., 2005）。与此一致，本研究prph:EGFP 品系可视化了成体肢体再生过程中大量外周神经长入芽基；但仍有几点需要注意。首先，尽管Prph在 DRG 来源的感觉与自主神经元中强烈表达，但据报道在大鼠运动神经元中表达有限（Brody et al., 1989; Escurat et al., 1990）。未来构建神经元亚型特异性品系（如运动神经元标记hb9/mnx1）将更深入解析再生过程的神经依赖性。此外，需要利用可标记与示踪施万细胞与神经胶质细胞的报告品系，仔细评估其在肢体再生中的潜在贡献。

3.3 神经再生过程中的转录调控

在prph:EGFP 非洲爪蟾中，我们观察到幼蛙肢体再生过程中仅再生侧报告基因活性显著升高。这种激活可能反映了 DRG 响应轴突切断后的广泛转录变化。在大鼠中，坐骨神经损伤后的轴突再生阶段，DRG 神经元中Prph表达显著上调（Oblinger et al., 1989; Carol M. Troy et al., 1990; Wong and Oblinger, 1990）。此外，哺乳动物 PRPH 与创伤性神经损伤、神经病变相关，并被视为外周神经系统神经损伤的潜在生物标志物（Hol and Capetanaki, 2017; Keddie et al., 2023; Manco et al., 2025; Romano et al., 2022）。本品系可在体可视化轴突变性与再生过程中外周神经的动态变化，为发育、再生与病理状态下的神经可塑性研究提供优质工具。

在大鼠 PC12 细胞中，NGF 通过 Ets 家族转录因子激活Prph表达，该因子结合远端正向元件（Chang and Thompson, 1996; Thompson et al., 1992）。考虑到神经损伤后 DRG 中 NGF 与其他神经营养因子（如 BDNF、GDNF）上调（Lee et al., 1998; Song et al., 2008），这些因子可能也在肢体截肢后的再生信号诱导下表达。因此，我们推测损伤诱导的神经营养因子通过prph启动子与 1 号内含子区域 Ⅱ，协同 ETS 家族等转录因子上调prph表达。

本研究聚焦非洲爪蟾prph基因，其可作为肢体外周神经发育与再生的标记基因。我们构建了可在体可视化prph表达的转基因品系，为神经发育、变态与再生研究提供便利。外周神经再生与创伤性神经损伤、神经病变等人类疾病密切相关。先天性巨结肠是一种神经嵴相关疾病，可导致肠外周神经缺陷（Heuckeroth, 2018; Montalva et al., 2023）。由于受神经嵴转录因子调控的 PRPH 可标记肠神经节细胞并作为有用的诊断标记（Chisholm and Longacre, 2016），本转基因品系也可助力肠神经系统异常（包括先天性巨结肠）的研究。尽管哺乳动物再生能力有限，但与鱼类、两栖类等高再生能力物种的比较研究具有重要价值。非洲爪蟾变态过程中的大规模组织重塑涉及外周神经系统的全局重排（Marsh-Armstrong et al., 2004; Nakagawa et al., 2000），因此该转基因品系也将成为分析发育、变态与再生过程中大规模外周神经重塑的多功能资源与工具。

图表注释汇总

图 1 prph:EGFP 与内源性prph在胚胎中的表达

（A）VISTA 序列比较分析。非洲爪蟾（L 亚基因组）与热带爪蟾prph基因序列比对，显示启动子与 1 号内含子中的保守区域。（B）转基因构建体结构。白色方框表示爪蟾物种间 1 号内含子中的四个同源区域。包含第一外显子的prph.L启动子区域（914 bp，上游区域与 5' 非翻译区，分别为蓝色与橙色方框）、第二外显子（34 bp，部分编码区，带星号浅蓝方框）与 1 号内含子（4.7 kb）连接至 EGFP。（C）prph:EGFP 转基因胚胎与内源性prph表达全胚原位杂交（WISH）代表性图像。神经胚与尾芽期观察到神经元特异性 EGFP 表达，与 WISH 检测的prph表达模式一致。（D）prph:EGFP 转基因非洲爪蟾幼体报告基因代表性图像。缩写：ON，视神经；TN，三叉神经。

图 2 转基因爪蟾prph基因 1 号内含子的缺失与增强子分析

（A）prph 1 号内含子序列系列缺失分析总结与转基因胚胎 EGFP 荧光代表性图像。白色方框与灰色箭头分别表示同源区域与 CMV 最小启动子。星号表示 34 bp 第二外显子序列（浅蓝方框）。（B）非洲爪蟾与热带爪蟾同源区域 Ⅱ（内含子 1-Ⅱ）的顺式元件分析。公开的神经胚期热带爪蟾prph基因 ATAC-seq 数据显示该区域存在染色质可及峰，包含 JASPAR 预测的高迁移率族与同源异型框类型顺式元件。缩写：Basic，碱性螺旋 - 环 - 螺旋转录因子；High-mobility，高迁移率族结构域转录因子；Homeo，同源异型结构域转录因子；Nuclear，C4 锌指核受体转录因子。

图 3 prph:EGFP 在蝌蚪中的表达模式

（A）45 期在体 EGFP 报告基因表达模式。箭头指示背根神经节（DRG）。（B）报告基因 EGFP 免疫组化分析。52 期脊髓（SC）、室管膜层（VL）与 DRG 中清晰表达。52 期尾部冠状切片显示 EGFP 与乙酰化微管蛋白（AcTub）免疫反应共定位。箭头指示 DRG。（C）变态前阶段外周神经系统（PNS）中的 EGFP 表达。上图：54 期幼体侧面观。下图：方框区域（a、b、c）放大图，显示外周神经。箭头指示外周神经。注：尾部肌肉（A 中星号）为自发荧光背景，抗 EGFP 抗体无免疫信号（B 中 Mu）。

图 4 蝌蚪肢体发育与再生中外周神经模式的活体成像

（A）51 期至 55 期后肢发育过程中prph:EGFP 表达时序成像。51 期，从背根神经节（DRG，箭头）延伸至肢芽（箭头）的外周神经呈现强 EGFP 荧光。随后神经支配随肢体发育形态建成逐步扩展。（B）蝌蚪后肢再生过程中外周神经时序成像。检测时间点：截肢后 0 天（dpa；截肢即刻）、4 dpa（芽基形成）、7–9 dpa（骨板期）。虚线指示截肢平面。外周神经未大量侵入芽基，仅再生后期少量侵入。

图 5 变态后幼蛙前肢再生中外周神经模式的时序成像

（A）0 至 29 dpa（截肢后天数）前肢再生过程中外周神经 EGFP 时序成像，直至棘突形成。与幼体后肢再生不同，观察到大量外周神经侵入芽基。虚线指示截肢平面。截肢平面附近可见明亮的 EGFP 荧光团（A 中箭头），可能因神经支配过度密集所致。证实该信号在野生型幼蛙中不存在（图 S4），排除自发荧光可能。该报告基因荧光在 4–9 dpa 短暂出现，11–13 dpa 后无法检测（图 S5）。（B）芽基形成阶段（11 dpa）的大量外周神经支配。上图为在体成像放大图，下图为轴突标记物乙酰化微管蛋白（AcTub）、EGFP 与 DAPI 免疫组化切片。prph:EGFP 表达与乙酰化微管蛋白染色共定位，证实报告基因忠实地反映外周神经系统表达。虚线与实线分别指示截肢平面与表皮 - 间充质边界。Bl，芽基。

图 6 再生相关的prph:EGFP 表达激活

（A）幼蛙前肢再生腹面观在体 EGFP 成像。左侧为完整右侧前肢（正常，镜像），右侧为再生左侧前肢（再生，镜像）。再生侧前肢神经中的 EGFP 信号更强。虚线指示截肢平面。（B）完整（右侧，R）与再生（左侧，L）前肢离体神经。与在体成像一致，再生神经 EGFP 信号更强。（C）11 dpa 时完整（右前肢）与再生（左前肢）神经平均 EGFP 信号强度定量（Mann–Whitney U 检验；p<0.01，每组n=10）。