人类基因治疗｜基因编辑

本指南文件仅用于征求意见

请在《联邦公报》中发布的指南草案可用性通知所载明的日期前，提交一套电子版或纸质版意见。电子版意见请提交至https://www.regulations.gov；纸质版意见请提交至美国食品药品监督管理局案卷管理部门（HFA-305），地址：马里兰州罗克维尔市菲什巷 5630 号 1061 室，邮编 20852。所有意见均需标注《联邦公报》可用性通知中所列的案卷编号。

如需获取本指南的额外副本，可联系沟通、推广与发展办公室（OCOD），致电 1-800-835-4709 或 240-402-8010，发送邮件至 [email protected]，或访问官网https://www.fda.gov/vaccines-bloodbiologics/guidance-compliance-regulatory-information-biologics/biologics-guidances。

有关本指南内容的问题，可通过上述电话或邮箱联系沟通、推广与发展办公室（OCOD）。

美国卫生与公众服务部

食品药品监督管理局

生物制品评价与研究中心

2026 年 4 月

本文件含非强制性建议

草案—— 暂不实施

目录

一、引言 1

二、背景 2

三、适用范围 2

四、下一代测序技术（NGS）相关考量 3

五、靶向编辑位点评估相关考量 4

1.测序策略 5

2.靶向编辑位点评估的样本选择 5

六、脱靶编辑活性评估研究相关考量 5

A. 脱靶编辑分析所用样本 6

3.体外（离体）产品 6

4.体内产品 7

B. 技术平台特异性脱靶编辑位点筛选方法 7

5.脱靶编辑位点筛选的生化实验 8

6.脱靶编辑位点筛选的通用方法 9

2.1 脱靶编辑位点筛选的细胞实验 9

2.2 脱靶编辑位点筛选的生物信息学方法 9

2.3 基于下一代测序技术的脱靶编辑位点筛选方法 10

D. 验证性检测方法 11

E. 分析参数 11

F. 脱靶编辑位点报告 12

G. 其他考量 12

七、结合人类遗传变异开展脱靶编辑位点分析的相关考量 13

A. 数据库选择 13

B. 人群分层 13

C. 变异等位基因频率 14

D. 变异相关脱靶编辑位点的检索参数 14

E. 变异相关脱靶编辑位点的编辑潜能评估 14

F. 变异相关脱靶编辑位点报告 14

八、基于下一代测序技术的染色体完整性分析相关考量 15

九、向美国食品药品监督管理局提交脱靶编辑与染色体易位分析研究报告 15

十、参考文献 17

本文件含非强制性建议草案—— 暂不实施

利用下一代测序技术开展人类基因治疗产品基因组编辑安全性评估

行业指南草案

本指南草案一经定稿，将代表美国食品药品监督管理局（以下简称 FDA 或监管机构）对该主题的现行观点。本指南不为任何主体创设权利，对 FDA 及公众亦无法律约束力。若采用替代方案可满足适用法规要求，亦可实施。如需讨论替代方案，可联系扉页所列负责本指南的 FDA 工作人员。

一、引言

本指南针对支持人类基因组编辑（GE）研究性产品开展临床试验申报所需的非临床研究，提供基于下一代测序（NGS）技术的方法建议。本指南的建议是对 2024 年 1 月发布的《行业指南：含人类基因组编辑的人类基因治疗产品》（2024 年 1 月基因组编辑指南，参考文献 1）中所述非临床、临床及药学（CMC）相关考量的补充。

人类基因组编辑产品的临床研发项目，需同时考量基因治疗产品自身风险及基因组编辑带来的额外风险，包括针对遗传病（含个体化治疗）的疗法中存在的脱靶编辑与基因组非预期改变。有关人类基因组编辑产品临床研究设计考量及基于科学的获益 - 风险评估方法，详见 2024 年 1 月基因组编辑指南（参考文献 1）。

本指南建议可协助研发方设计非临床研究，通过下一代测序技术与生物信息学方法，评估人类基因组编辑产品的脱靶编辑风险及基因组完整性受损相关安全风险，相关研究数据可用于支持研究性新药（IND）申请与生物制品许可申请（BLA）。

通常而言，FDA 发布的指南文件（含本指南）不具备法律强制约束力。除非引用特定法规要求，否则指南仅为 FDA 对相关主题的现行观点，仅作建议使用。FDA 指南中使用的 “应” 表述，意为建议或推荐，而非强制要求。

本指南由美国食品药品监督管理局生物制品评价与研究中心（CBER）治疗产品办公室（OTP）编制。

本指南全文中，含基因组编辑的人类基因治疗产品统称为人类基因组编辑产品。本指南所定义的人类基因组编辑，是指通过核酸酶依赖或非依赖型基因组编辑技术，在体外（离体）或体内对人体体细胞基因组特定位点的 DNA 序列进行添加、缺失、改造或替换的过程。

二、背景

基因组编辑工具（编辑酶）可在基因组、表观基因组或转录组的特定（即预期靶向）位点实施编辑。不同基因组编辑工具的序列识别机制与作用模式各异，衍生出多种基因组编辑技术平台。例如，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关（Cas）系统，需在前间隔序列邻近基序（PAM）存在的前提下，通过向导 RNA（gRNA）靶向识别含互补序列的特定基因组位点并完成编辑。随着多种具备不同 PAM 序列要求与核苷酸编辑能力的 Cas 蛋白被发现，该系统的应用场景大幅拓展。此外，将 Cas 蛋白与脱氨酶、逆转录酶、DNA 甲基转移酶等不同效应分子融合，进一步丰富了基因组编辑工具库。

与 CRISPR-Cas 系统不同，大范围核酸酶、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）等技术平台，通过蛋白结构域识别特定 DNA 序列。随着研究持续推进，新型可编程、高特异性编辑技术将不断涌现，基因组编辑领域仍将快速发展。

研发方已采用多种基因组编辑技术平台开展体外（离体）或体内细胞编辑。具体而言，可对患者来源细胞（自体）或健康供体细胞（异体）进行体外（离体）编辑；也可通过编码编辑酶的信使 RNA（mRNA）或携带编辑酶编码序列的 DNA 载体，在体内完成细胞编辑。

无论采用何种方式，基因组脱靶（即非预期）位点编辑及 / 或染色体易位均存在潜在安全风险，此类编辑可能损害细胞正常功能。因此，充分评估人类基因组编辑产品的脱靶编辑风险及对染色体完整性的影响，对最小化靶细胞或组织的非预期基因组改变至关重要。

脱靶编辑研究通过计算机模拟及 / 或下一代测序技术，评估各类基因组编辑产品的脱靶编辑活性。本指南针对基于下一代测序技术的脱靶编辑活性评估、染色体完整性评估、靶向编辑位点评估、测序方法、样本选择及向 FDA 提交研究结果等方面，提出 FDA 的具体建议。

三、适用范围

本指南适用于研发含基因组编辑技术的人类基因治疗药物的研发方。2024 年 1 月基因组编辑指南将人类基因组编辑定义为对人体体细胞基因组特定位点的 DNA 序列进行添加、缺失、改造或替换的过程（参考文献 1）。

但基因组编辑领域的快速发展，已催生可修饰表观基因组或切割 RNA 序列的编辑技术。本指南中，人类基因组编辑产品亦包括可编辑表观基因组或转录组的产品，基于下一代测序技术的脱靶编辑活性评估建议适用于所有此类产品。

研发方常规采用下一代测序技术与生物信息学工具评估药物的脱靶编辑风险。本指南针对各类基因组编辑技术平台（包括 DNA 编辑酶、表观遗传编辑酶、RNA 切割编辑酶），提供基于下一代测序与生物信息学的非临床研究建议，用于评估脱靶编辑风险及对染色体完整性的影响。

四、下一代测序技术（NGS）相关考量

下一代测序技术与生物信息学工具可通过靶向方法特异性评估基因组位点，或通过全基因组方法全面扫描基因组，实现高灵敏度、定量化检测。具体而言，可采用靶向测序或全基因组测序方法，筛查基因组编辑酶引发的非预期基因组改变。

本部分针对下一代测序技术在脱靶编辑位点评估及基因组编辑细胞靶向 / 非靶向基因组改变检测中的应用，提出具体建议。

研发方应采用适配靶向与脱靶编辑位点分析目标的测序策略。例如，评估短片段 DNA（≤50bp）改变的靶向 / 脱靶位点编辑时，基于短读长测序的策略（short-read sequencing-based methods）即可满足需求。但若需检测长片段序列的大片段插入或缺失，则需采用可识别此类改变的长读长测序策略（long-read sequencing-based methods）。

测序需使用足量样本（基因组 DNA、细胞数量或 RNA 等），且测序深度需足以检测频率低于靶向编辑率的潜在脱靶编辑事件。研发方应提供内部实验数据（如测序建库的代表性数据）及 / 或同行评审文献的相关信息，证明测序深度的合理性与检测灵敏度，支持低频脱靶编辑事件的检测策略。如适用，建议采用降低 PCR 扩增偏倚及 / 或引物偏倚的策略。

下一代测序与数据分析的详细报告需包含以下内容：

1.细胞类型、所用细胞数量（如适用）、核酸提取量、核酸提取流程、文库制备、引物信息（如适用）及测序方法的详细描述。

2.用于序列质量 / 深度评估、序列比对（如适用）及其他序列分析步骤的生物信息学工具，及命令行界面（CLI）信息。需附相关文献及数据库信息（如适用）。

3.分析所用参考序列与数据库。

4.序列分析各步骤的简要描述，含测序数据处理各环节的验收标准（如适用）。验收标准需包括测序质量、测序深度及序列比对指标的验收要求。

5.下一代测序数据分析结果及相关元数据，需以文本、CSV 或 Microsoft Excel 表格形式提交（如适用）。

五、靶向编辑位点评估相关考量

靶向位点是编辑酶预期编辑的基因组或转录组特定序列。靶向编辑率可通过对靶向位点测序，统计含预期编辑的测序读数占靶向位点总读数的比例计算。研发方应以比值或百分比形式报告靶向编辑率。

用于靶向与脱靶位点分析的样本，需采用适宜编辑参数处理，确保靶向编辑率与最终药物产品的预期编辑率一致。达到预期靶向编辑率，可保证样本中基因组编辑酶活性处于最优水平。研发方应报告体外研究的靶向编辑率，并可利用该数据佐证脱靶编辑活性检测方法的合理性（如可行）。

此外，研发方需采用适宜的测序方法，在合适样本中检测并报告靶向基因组编辑位点的预期与非预期编辑率（样本选择建议见第六部分 A 节）。以下为靶向编辑谱分析的测序策略与样本选择具体建议。

1.测序策略

研发方应采用靶向测序策略，精准检测靶向基因组位点的预期编辑率。若编辑技术仅引发单核苷酸改变（如单碱基替换、缺失或插入）或短片段核苷酸改变（如短片段插入缺失），推荐采用短读长或长读长测序方法评估靶向编辑位点。

若编辑技术可引发 DNA 双链断裂，及 / 或可能导致长片段 DNA 非预期改变（>50bp 至数千碱基对的插入或缺失），则需采用长读长测序方法开展靶向编辑位点分析。研发方需提供依据，证明靶向编辑位点分析所用测序方法的合理性。

如适用，研发方应采用足够的测序深度与适宜的偏倚降低策略（下一代测序技术考量见第四部分），以检测频率低于预期编辑率的非预期编辑结果。靶向编辑位点分析数据，需以表格形式列出所有检测到的编辑事件（替换、插入、缺失）及对应的编辑频率（编辑率）。

2. 靶向编辑位点评估的样本选择

合理设计的靶向编辑位点谱分析策略，样本需满足：体外（离体）基因组编辑产品采用与药物编辑细胞完全一致的细胞样本；体内基因组编辑产品采用与药物作用靶点细胞类型具有代表性的细胞样本（样本选择补充建议见第六部分 A 节）。

六、脱靶编辑活性评估研究相关考量

对于 DNA 编辑酶与表观遗传编辑酶，脱靶编辑位点是指发生编辑活性但非预期编辑的基因组序列；对于 RNA 编辑酶，脱靶编辑位点是指引发基因表达非预期改变的转录组序列。此类脱靶位点与预期编辑的靶向位点存在一定程度的同源性或序列相似性。

本部分针对脱靶编辑位点筛选、验证及分析参数提出建议，具体包括样本选择、技术平台特异性 / 通用型脱靶位点筛选方法、研究描述所需信息及研究结果报告要求。

为保证脱靶编辑活性检测方法的可重复性与灵敏度，建议研发方采用适宜的下一代测序方法（下一代测序技术考量见第四部分）、合适的样本（样本考量见第六部分 A 节），确保样本达到靶向位点预期编辑率（靶向编辑位点评估见第五部分），并设置生物学重复。

A. 脱靶编辑分析所用样本

脱靶编辑位点筛选与验证性研究需设置多个生物学重复。推荐采用患者或健康供体来源的人类细胞；若无法获取原代人类细胞，可采用具有代表性的永生化人类细胞系，并提供科学依据与数据证明所选样本的合理性。

建议研发方采用与体外（离体）或体内预期编辑靶细胞类型具有代表性的细胞，样本选择还受编辑方式（体内 / 体外）、样本可得性、细胞体外培养适配性等因素影响。

1. 体外（离体）产品

体外（离体）基因组编辑产品的脱靶编辑活性研究，需采用与药物生产编辑细胞完全一致的细胞类型。此外，脱靶风险评估样本的靶向编辑率，需与最终药物产品的检测编辑率一致。

若编辑策略旨在矫正患者细胞的突变，建议采用患者来源样本或经基因改造携带目标突变的正常细胞，便于报告靶向位点编辑率。研发方可在合适情况下采用健康供体样本，并提供科学依据证明该方案的合理性。若选择的细胞类型与预期编辑细胞不同，需提供科学依据证明样本选择策略的合理性。

2. 体内产品

体内产品的脱靶编辑活性评估，建议采用与药物体内靶组织具有代表性的细胞类型，编辑参数需使靶向位点达到预期编辑率。

若无法获取合适细胞类型、细胞获取难度大或细胞不适于体外研究，研发方可采用替代方法或细胞样本开展脱靶编辑活性研究，并提供科学依据证明该策略的合理性。例如，可采用需要基因组 DNA 样本的生化实验进行脱靶编辑位点筛选。

若预期编辑旨在矫正致病突变，采用健康供体样本无法评估靶向编辑率。此类情况下，建议采用患者来源细胞或经基因改造携带目标突变的正常细胞开展脱靶编辑活性评估。若因疾病严重程度、罕见性、患者细胞可得性等原因无法使用携带目标突变的细胞，研发方可采用健康供体样本，并提供科学依据证明该方案的合理性。

最后，2024 年 1 月基因组编辑指南（参考文献 1）所述的生物分布研究数据，需作为是否在药物分布的非靶组织 / 器官代表性细胞中开展额外靶向位点分析、脱靶位点筛选与验证的依据。

采用细胞实验评估脱靶编辑活性时，推荐采用与体内药物完全一致的递送方式（如脂质纳米粒 LNP、腺相关病毒载体 AAV、电转染等）。若体内递送方式不适用于体外细胞系统，研发方可采用替代方式递送基因组编辑组分。开展此类研究时，研发方需检测编辑酶表达水平、靶向编辑率，并将数据纳入研究报告。研发方还需提供科学依据（如适用），证明研究中样本选择、递送方式及编辑参数的合理性。

B. 技术平台特异性脱靶编辑位点筛选方法

2024 年 1 月基因组编辑指南（参考文献 1）建议采用细胞实验、生化实验、生物信息学方法等多种手段进行脱靶位点筛选。细胞实验采用体外编辑培养细胞的基因组 DNA 开展脱靶分析；生化实验则采用体外编辑的纯化基因组 DNA 进行分析。后续需完成文库制备、下一代测序及测序数据生物信息学分析（下一代测序技术考量见第四部分）。

细胞实验与生化实验最初用于评估可引发基因组双链断裂的编辑酶脱靶活性，目前已优化或开发出新方法，可检测基因组单链断裂 / 切口。因此，研发方需结合拟用编辑酶的作用模式，选择合适的脱靶位点筛选方法。

例如，针对双链断裂的脱靶编辑检测方法，不适用于碱基编辑酶引发的单链切口检测。此类情况下，研发方可采用经优化的实验方法，通过核酸内切酶在单链切口位点制造双链断裂，便于测序后检测编辑事件。

研发方选择已发表的技术平台特异性脱靶编辑分析方法时，需结合拟用编辑酶的作用模式，并通过引用同行评审文献及 / 或提供内部实验数据证明策略合理性。对已发表方案的任何修改，需提供内部实验数据证明修改后方法的合理性。

脱靶编辑活性检测方法的重大修改，指研发方对实验设计做出的、未在既往文献中描述的核心调整。为证明此类修改的合理性，研发方需提供额外信息或研究，证明修改未影响方法灵敏度、数据质量，也未引入偏倚。

若采用全新、未发表的脱靶分析方法，研发方需提供额外信息证明方法的合理性与灵敏度。对于 CRISPR-Cas 系统产品，可通过新方法检测广泛研究的向导 RNA 的脱靶位点，并与现有方法对比，证明新方案的合理性；对于非 CRISPR-Cas 系统的编辑技术，可采用类似方法开发脱靶编辑检测方法，并通过设置阳性对照佐证。

每项脱靶编辑位点筛选研究的结果，需以表格形式列出筛选出的脱靶位点（脱靶位点报告建议见第六部分 F 节）。以下为技术平台特异性实验的具体建议。

1.生化实验与细胞实验的研究报告需包含以下内容：

i. 样本的详细描述，明确样本来源（健康供体 / 患者），并说明脱靶活性评估样本是否含编辑酶识别序列，以支持靶向编辑率检测。

ii.基因组编辑组分的浓度。

iii.靶向编辑率（如适用）、每个样本的总测序深度、靶向位点与所有检测到的脱靶位点的读数计数。

2.细胞实验筛选脱靶编辑位点时，实验样本的靶向编辑率需与最终药物产品的预期 / 检测靶向编辑率一致（靶向编辑位点评估建议见第五部分）；若不一致，研发方需证明细胞脱靶实验中编辑率设置的合理性。

C. 脱靶编辑位点筛选的通用方法

若尚无成熟的实验方法（生化 / 细胞实验）评估特定类型 / 类别基因组编辑技术的安全性，研发方可采用其他通用型方法筛选脱靶编辑位点，包括计算机算法或成熟的下一代测序技术。

1. 脱靶编辑位点筛选的生物信息学方法

脱靶编辑位点数量与风险的核心决定因素之一，是向导 RNA 或靶序列与人类基因组其他区域的序列同源性。生物信息学（计算机模拟）算法可扫描参考基因组，识别与输入向导 RNA 序列具有同源性的其他基因组区域。研发方采用生物信息学脱靶位点筛选工具时，需遵循以下要求：

i.对于 CRISPR-Cas 系统产品，基于同源性的脱靶位点检索需包含DNA 与向导 RNA 的错配、凸起，同时需结合 PAM 序列要求或其他技术平台特异性序列要求开展同源性检索（分析参数建议见第六部分 E 节）。

ii.对于其他编辑技术平台，可采用类似的基于序列同源性的生物信息学检索方法，纳入序列变异因素筛选脱靶编辑位点。例如，可通过编辑酶 DNA 结合结构域识别的靶序列，扫描人类基因组，基于同源性筛选潜在脱靶位点。

iii.需提供检索参数设置的科学依据，可引用同行评审文献或提供内部实验数据佐证。

2. 基于下一代测序技术的脱靶编辑位点筛选方法

现有下一代测序技术可评估基因组 / 转录组 / 表观基因组改变或定量 mRNA 丰度。研发方可根据药物所用编辑酶的作用模式，选择可检测细胞预期编辑的下一代测序方法。

例如，采用表观遗传编辑酶靶向甲基化特定基因组位点的药物，其脱靶编辑风险需通过基于下一代测序的全基因组 DNA 甲基化分析评估。采用合适的下一代测序方法，可实现各类基因组编辑技术平台的脱靶编辑分析，无论编辑酶靶向基因组、转录组或表观基因组。

实施此类方法的实验策略与分析参数的合理性，需通过引用同行评审文献或内部分析数据佐证。除第四部分下一代测序技术应用建议与第五部分靶向编辑位点评估建议外，采用下一代测序开展脱靶位点评估时，还需遵循以下补充要求：

i.需提供测序质量与深度验收标准，并提供科学依据证明方法的灵敏度、基因组 / 外显子覆盖度（如适用）合理性与可重复性。

ii.基于碱基质量、比对质量筛选测序读数或变异的步骤，需提供科学依据。

iii.确定脱靶位点编辑的其他所有因素，需列明并提供合理依据（如适用）。

D. 验证性检测方法

研发方需采用合适的细胞类型，验证筛选出的脱靶编辑位点并检测位点编辑频率。验证性检测方法可包括探针序列富集、靶向序列扩增及 / 或其他等效方法。

建议对所有筛选出的脱靶位点开展验证性检测；若仅选择部分位点检测，需提供科学依据证明策略合理性。位点筛选依据可包括统计阈值、编辑率阈值、多位点样本检出情况等，但需避免采用过严的筛选标准，确保可评估筛选位点的编辑率。

开展验证性检测时，研发方需选择最小化偏倚的测序策略，并采用预设的测序深度与质量，确保可检测低频编辑事件（测序考量见第四部分）。研发方可报告验证性检测方法的灵敏度及其他信息，作为检测策略的依据。

验证性检测需在合适的细胞类型中开展（见第六部分 A 节）。此外，建议设置未编辑对照组与编辑组配对样本，检测靶向位点与所有脱靶位点的编辑率。本研究报告的靶向位点编辑率，需与研发方最终药物产品的预期靶向编辑率一致。验证性研究结果报告建议见第六部分 F 节。

E. 分析参数

脱靶编辑位点筛选与验证研究的分析参数，与实验设计及下一代测序方法特异性相关。对于可识别多种 PAM 序列的 CRISPR-Cas 编辑酶，脱靶位点鉴定策略需纳入所有 PAM 序列类型。

例如，酿脓链球菌 Cas9（spCas9）的经典 PAM 序列为 NGG，但该酶也可识别非经典 PAM 序列。研发方需引用同行评审文献或内部实验数据（如适用），证明 PAM 序列选择 / 排除策略的合理性。

对于无偏全基因组 / 外显子 / 转录组 / 表观基因组测序或靶向测序产生的下一代测序数据，需报告数据分析的筛选参数并提供科学依据。其他测序方法特异性分析参数，也需报告并提供依据。

数据分析步骤与参数描述，参考第四部分与第六部分 C.2 节建议。

F. 脱靶编辑位点报告

报告筛选与验证的脱靶编辑位点时，需提供对应脱靶分析研究的读数计数及 / 或编辑频率（如适用）。此外，建议研发方说明脱靶位点基因组坐标的注释工具。

筛选与验证研究报告的所有脱靶位点注释列表，需包含以下内容：

i.基因组坐标信息。

ii.与向导 RNA 或靶序列的错配数与凸起数。

iii.CRISPR-Cas 系统产品的 PAM 序列信息。

iv.脱靶位点的基因间区、外显子、内含子归属，并补充以下信息（如适用）：

a.基因间区脱靶位点：需提供距最近基因的距离，并分析对启动子或调控区域的影响。

b.外显子脱靶位点：需报告关联基因名称与功能，并分析基因组编辑对氨基酸序列、基因表达与剪接的影响。

c.内含子脱靶位点：需报告距最近外显子的距离，并分析对剪接的潜在影响。

对于所有验证的脱靶编辑位点，研发方需提交基于现有认知的风险评估总结，包括关联基因组位点的同行评审文献、基因表达信息（如适用）、基因疾病关联研究数据（如可用）及其他相关信息。

G. 其他考量

药物脱靶编辑活性还受编辑酶氨基酸修饰、编辑酶递送方式等因素影响（脱靶活性评估研究的递送方式建议见第六部分 A.2 节）。

若通过改变氨基酸残基修饰编辑酶，调控编辑活性及 / 或特异性，需详细描述此类修饰，并提供内部实验数据或引用同行评审文献，证明修饰后编辑酶的活性与特异性变化。脱靶编辑活性研究需采用最终药物产品所用的基因组编辑酶。

编辑酶表达的持续性对安全性评估至关重要。例如，通过脂质纳米粒递送信使 RNA 的编辑酶，其活性持续时间短于腺相关病毒载体递送的同一种编辑酶，该信息需纳入安全性评估。若编辑技术可在细胞内长期稳定表达（如腺相关病毒载体递送的编辑酶、体内递送编辑酶），需提供额外的长期脱靶编辑风险评估。

七、结合人类遗传变异开展脱靶编辑位点分析的相关考量

人类个体基因组存在数百万个核苷酸变异。对于 CRISPR-Cas 编辑酶，部分变异可能降低基因组位点与向导 RNA 的错配数，或创造 PAM 序列，形成新的潜在可编辑基因组位点。

同理，对于其他编辑技术平台，变异可能降低靶序列与基因组脱靶位点的错配数，提高编辑酶序列识别结构域的识别效率。上述情况中，携带特定变异的个体将面临脱靶编辑风险。

合理的、纳入人类遗传变异的生物信息学脱靶分析方法，需可报告变异相关的潜在脱靶编辑位点。以下为本分析的具体建议与补充考量。

A. 数据库选择

研发方应选择含健康 / 患者人群变异信息的人类遗传变异数据库，变异信息需来自已发表的公共基因组数据库或等效来源。需结合目标人群疾病患病率、常见核苷酸变异认知、致病变异信息，提供选用单个 / 多个数据库的科学依据。

B. 人群分层

若基因组编辑药物用于治疗患病率明确的疾病，研发方可基于特定遗传祖先人群的疾病患病率，按等位基因频率筛选变异，构建纳入遗传变异因素的生物信息学脱靶位点筛选策略。需提供科学依据证明人群分层分析策略的合理性。

C. 变异等位基因频率

建议纳入基因组中常见与罕见变异开展生物信息学分析。研发方可采用数据库中所有变异，或提供科学依据选择高于特定频率的变异进行分析。建议纳入所有基因区与基因间区变异，并提供等位基因频率阈值设置的科学依据。

D. 变异相关脱靶编辑位点的生物信息学检索参数

研发方需采用可识别变异提高向导 RNA（或靶序列）与基因组位点同源性的检索标准，包括降低错配数及 / 或减少缺口。对于 CRISPR-Cas 系统产品，需额外纳入创造 PAM 序列、提高脱靶编辑潜能的变异。

E. 变异相关脱靶编辑位点的编辑潜能评估

研发方可开展额外分析，评估变异相关脱靶位点的编辑潜能，包括在携带目标变异的样本或基因组样本中检测编辑率的实验方法，或输出编辑潜能评分 / 指标的计算机模拟方法。

F. 变异相关脱靶编辑位点报告

纳入人类遗传变异的脱靶编辑位点分析详细报告，需包含以下内容：

i.所用数据库、变异频率阈值、人群分层策略的详细描述及科学依据。

ii.鉴定变异相关脱靶编辑位点的具体标准。

iii.分析结果需以注释列表形式提交，格式为文本、Microsoft Excel 或 CSV 文件（可行情况下）。注释信息参考第六部分 F 节。

八、基于下一代测序技术的染色体完整性分析相关考量

对于已知可引发 DNA 双链断裂及 / 或中大片段插入缺失（indels）的基因组编辑技术，双链断裂位点的错误 DNA 修复过程可能引发染色体易位，影响编辑后细胞的基因组完整性。此类情况下，建议采用高灵敏度、定量的下一代测序方法评估编辑细胞的基因组完整性。

研发方可选择靶向测序、引物测序或其他全基因组下一代测序方法，检测低频易位事件，并报告基因组编辑中双链断裂靶向位点间的染色体易位率。建议采用高灵敏度、低偏倚的测序策略开展此类分析（下一代测序技术考量见第四部分）。

若药物安全性分析检出验证的脱靶编辑位点，需额外评估靶向与脱靶位点间的潜在易位事件。样本选择参考第六部分 A 节，测序考量参考第四部分，位点注释报告参考第六部分 F 节。

九、向美国食品药品监督管理局提交脱靶编辑与染色体易位分析研究报告

所有建议的非临床脱靶编辑与染色体易位研究，需按照本指南要求完成，并在提交初始研究性新药（IND）申请前完成。详细研究报告需包含本指南所有建议信息，并与初始 IND 申请一并提交。脱靶编辑与染色体易位研究结果，需按建议格式随初始 IND 申请提交。

部分情况下（如适应症为超罕见病、或用于单患者治疗），初始 IND 申请无需提交纳入人类遗传变异的脱靶编辑分析。建议研发方在提交 IND 申请前，与 FDA 讨论研究方案。

具体而言，建议研发方在 INTERACT 会议或 IND 前会议阶段，与 FDA 讨论脱靶编辑活性评估策略（参考文献 2、3）。研发方可在预提交文件中简要说明脱靶分析方案，预提交文件需包含的核心信息如下表所示。

若生产工艺重大变更影响编辑酶活性及 / 或靶向位点编辑率，进而可能改变药物脱靶位点谱，药物研发过程中需开展额外脱靶编辑分析。此外，若发现安全性问题，也需补充脱靶编辑分析。

建议研发方通过正式会议渠道，与 FDA 讨论生产工艺变更对药物脱靶编辑风险的影响（参考文献 3）。

在 IND 项下开展的临床研究或生物制品许可申请（BLA）提交阶段，研发方可能需要提交原始测序数据及分析所用软件脚本。研发方需在药物研发过程中及 / 或 BLA 提交前，与 FDA 沟通相关要求。

各类提交类型需提交的最低信息

X. 参考文献

1. Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing; Guidance for Industry, January 2024, https://www.fda.gov/media/156894/download. 

2. OTP Pre-IND Meetings, last updated Aug. 2024, https://www.fda.gov/vaccines-blood- biologics/cellular-gene-therapy-products/otp-pre-ind-meetings. 

3. Formal Meetings Between the FDA and Sponsors or Applicants of PDUFA Products; Draft Guidance for Industry*, Sept. 2023, https://www.fda.gov/media/172311/download.