怎么才能“冬眠”？

一种可实现小鼠安全长期蛰伏的神经环路的鉴定

Kexin Tong, Jingrui Yang, Feixiang Yuan, Min Tang, Yeting Gan, Shangming Wu,

Xinyuan Tong, Peixiang Luo, Shanghai Chen, Hongbin Ji and Feifan Guo*

复旦大学中山医院内分泌与代谢科

摘要

蛰伏（torpor）是一种受调控的低体温与低代谢状态，是部分哺乳动物关键的生存策略。既往研究已明确神经元调控在启动急性蛰伏中的核心作用。然而，神经调控能否安全、长期维持蛰伏状态，以及其具体调控通路，仍悬而未决，这也限制了该技术的转化应用潜力。本研究在小鼠中鉴定出一类表达通用调控去抑制蛋白 2（General control nonderepressible 2，GCN2）的特异性视前区神经元群（简称 G 神经元），该神经元群对蛰伏的诱导既必需又充分。令人瞩目的是，对 G 神经元进行持续性、选择性激活，可诱导稳定、长达数周的蛰伏状态（G 神经元驱动的长期蛰伏，G neuron-driven long-term torpor，GLT），动物从该状态苏醒后无明显行为缺陷与组织病理损伤。相比之下，对同一脑区进行全神经元激活所诱导的长期蛰伏（PLT），会在复苏后引发多处组织损伤，凸显了 G 神经元选择性通路独有的安全性。在小鼠肿瘤模型中，GLT 可直接抑制肿瘤增殖，并显著提升肿瘤对化疗的敏感性，实现了显著的治疗效果。综上，本研究解析了一类可安全介导长时间蛰伏的特异性神经元群，建立了诱导稳定、持续性低代谢状态的特异性范式，为基础生理学研究提供了变革性平台，并为癌症等慢性疾病的临床治疗开创了前沿策略。

引言

为在环境挑战下维持内环境稳态，生物体演化出复杂的生理适应机制。蛰伏以体温与代谢率大幅降低为特征，是一种极端却在演化上高度保守的节能生存策略。当能量匮乏时，蛰伏使动物通过周期性抑制生理功能大幅减少能量消耗，而非持续进行觅食等高耗能活动，从而提升生存率。该现象存在多种表现形式，从冬眠时的多日蛰伏，到非冬眠动物（如实验小鼠）的日间蛰伏—— 小鼠在一天内会出现短暂的低体温与低代谢发作。

调控蛰伏的神经结构是当前研究热点。已有研究证实多个关键脑区参与蛰伏调控，包括视前区（preoptic area，POA）、下丘脑背内侧核、延髓腹外侧区、最后区以及孤束核。POA 是体温调节的核心中枢，其中已鉴定出多类调控蛰伏启动的神经元群，包括表达垂体腺苷酸环化酶激活多肽（ADCYAP1）、焦谷氨酰 RF 酰胺肽（QRFP）、雌激素受体 α（ERα）、前列腺素 EP3 受体（EP3R）以及囊泡谷氨酸转运体 2（VGLUT2）的神经元。尽管蛰伏调控的神经图谱日渐清晰，但仍有其他关键调控神经元有待发现。

安全诱导蛰伏的前景具有深远的临床意义。为实现蛰伏的治疗性应用，多种诱导策略相继被开发，从全身给药到现代神经调控手段（如化学 / 光遗传学操控、靶向超声与深部脑刺激）。这些方法虽可诱发急性蛰伏，在急性缺血再灌注损伤与器官移植等急症中展现临床潜力，但存在显著局限：诱导状态持续时间极短，仅为数小时至最多两天。这种时间上的限制，是将低体温、低代谢效应转化应用于慢性疾病的主要障碍。这向该领域提出两大核心问题：第一，能否通过特定手段实现稳定、长期的蛰伏；第二，动物能否从这种长时间状态中安全复苏，不遗留持久的生理或行为损伤，抑或负责安全维持蛰伏的特异性生物学通路尚未被揭示。解答这些问题，是释放蛰伏全部治疗潜力的关键。

本研究将目光投向通用调控去抑制蛋白 2（GCN2）。GCN2 是一种演化上古老的激酶，可作为细胞感知氨基酸缺乏与禁食等营养应激的感受器，介导多种对生存至关重要的适应性改变。GCN2 在多个脑区高表达，包括杏仁核、前梨状皮质、弓状核以及内侧视前区（medial POA，MPA）—— 该脑区已知在响应禁食诱导蛰伏的过程中发挥关键作用。上述发现提示，表达 GCN2 的神经元是一类极具研究价值、却尚未被探索的候选细胞群，可响应禁食刺激并参与蛰伏启动调控。尽管中枢 GCN2 的多种生理功能已被逐步阐明，但由其表达所定义的神经元群的功能仍属空白。本研究旨在验证上述假说，并探索这类新型细胞的转化潜力。

本研究报道在小鼠前腹侧内侧视前区（anterior and ventral MPA，avMPA）发现一类未被表征的 GCN2 表达神经元（avMPA^GCN2，简称 G 神经元），该神经元群对小鼠蛰伏的诱导既必需又充分。值得注意的是，本研究证实选择性、持续性激活 G 神经元，可诱导稳定、长达数周且完全可逆的蛰伏状态，命名为GLT（G 神经元驱动的长期蛰伏），并利用这一人工诱导状态在小鼠肿瘤模型中揭示其治疗潜力。

结果

G 神经元在禁食诱导的蛰伏中被激活，抑制该神经元可消除禁食诱导的蛰伏

为阐明蛰伏启动的神经机制，本研究参照既往方法，在 8–12 周龄雄性 C57BL/6J 野生型（WT）小鼠中建立禁食诱导的日间蛰伏模型（图 1a）。禁食 24 小时后，小鼠出现典型蛰伏发作，核心体温（T_core）快速降至 31 ℃以下，持续低体温后可自发苏醒恢复至基线水平，植入式遥测探针记录结果证实上述变化（图 1b、c，附图 1a）。红外热成像结果与之吻合，棕色脂肪组织（BAT，哺乳动物非战栗产热主要器官）表面温度（T_BAT）与直肠温度同步变化（附图 1b–d）。与自由进食对照组相比，禁食小鼠还表现出显著的低代谢状态，耗氧量（VO₂）、能量消耗（HEAT）与呼吸交换率（RER，VCO₂/VO₂）等代谢指标均明显降低（图 1d，附图 1e）。

为探究 MPA 内 GCN2 表达神经元是否参与禁食诱导的蛰伏，本研究在禁食后 13 小时（本研究与既往研究观察到体温降幅最剧烈的时间点）进行免疫荧光（IF）检测。Fos（神经元活性标志物）、GCN2 与 NeuN（神经元标志物）三重免疫荧光染色显示，仅 avMPA（前囟：+0.50、+0.38 mm）内的 GCN2 表达神经元出现强烈 Fos 表达，而 MPA 后部（pMPA，前囟：−0.10 mm）无此现象（图 1e、f）。这种解剖位置局限的激活模式，与既往 MPA 亚区在蛰伏调控中的特征一致。

为明确 avMPA 内 GCN2 表达神经元对蛰伏是否具有功能必要性，本研究利用自主构建的Gcn2-Cre 转基因品系，实现 Cre 依赖性靶向操控 GCN2 表达细胞（附图 2a）。研究向Gcn2-Cre 小鼠 avMPA 双侧注射编码 Cre 依赖性抑制型人工设计药物专一激活受体（Designer ReceptorsExclusively Activated by Designer Drugs，DREADDs）的腺相关病毒（AAV-DIO-hM4Di-mCherry），并以仅注射 mCherry 的 AAV（AAV-DIO-mCherry）作为对照（图 1g）。腹腔注射 DREADDs 激动剂氯氮平 - N - 氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）可有效抑制 hM4Di 表达神经元的 Fos 表达（图 1h），证实功能抑制效果。关键结果显示，禁食期间经 CNO 抑制 G 神经元，可阻止禁食诱导蛰伏所特有的低体温（T_core低于 31 ℃）与 T_BAT下降（图 1i–l，附图 2b）。此外，抑制组最低耗氧量显著高于对照组（图 1m）。自由进食状态下，两组小鼠体温与代谢指标无显著差异，仅抑制组注射 CNO 后短暂出现 T_BAT与直肠温度升高（附图 2c–h）。上述结果共同证明，avMPA 内以 GCN2 为标记的 G 神经元活性，是禁食诱导蛰伏必不可少的条件。

为验证 G 神经元是否为功能独立的神经元群，本研究分析了其神经元组成，以及与既往已鉴定的 MPA 蛰伏调控神经元群的关系。GCN2 与 NeuN 共染显示，G 神经元约占该区域全部神经元的 68.0%，均匀分布于整个区域（附图 3a）。为明确 G 神经元的神经化学特性，本研究在 Vglut2（兴奋性谷氨酸能神经元标志物）或囊泡 GABA 转运体（Vgat，抑制性 GABA 能神经元标志物）启动子控制下表达荧光报告基因的转基因小鼠（Vglut2-ai9、Vgat-ai9 小鼠）中，进行 GCN2 与 NeuN 共染。G 神经元中，27.75% 为兴奋性（Vglut2⁺），53.07% 为抑制性（Vgat⁺）（附图 3b、c），提示该神经元群具有异质性。此外，32.75% 的 G 神经元共表达 ERα，42.92% 共表达 ADCYAP1（附图 3d、e）。G 神经元虽与既往鉴定的蛰伏调控神经元存在部分重叠，但大量非重叠区域证实，G 神经元是一类全新的蛰伏调控神经元群。

单独激活 G 神经元即可诱导小鼠进入蛰伏状态

为验证激活 G 神经元是否足以触发蛰伏，本研究向Gcn2-Cre 小鼠 avMPA 双侧注射编码 Cre 依赖性激活性 DREADDs 的 AAV（AAV-DIO-hM3Dq-mCherry，G-hM3Dq 小鼠），并以仅注射 mCherry 的 AAV 作为对照组（图 2a）。CNO 给药后，hM3Dq 表达 G 神经元被激活，Fos 染色结果证实激活效果（图 2b）。

CNO 给药后，G-hM3Dq 小鼠 T_core快速下降并低于 31 ℃，持续超过 72 小时；而对照组小鼠全程 T_core维持在 35 ℃以上（图 2c），T_BAT呈同步下降（图 2d、e）。此外，与对照组相比，G-hM3Dq 小鼠出现持续且显著的低代谢状态（图 2f，附图 4a、b）。G-hM3Dq 小鼠直肠温度变化趋势相似，体重轻微下降，摄食量显著减少（附图 4c–e）。雌性 G-hM3Dq 小鼠也观察到一致的蛰伏表型（附图 5a–g）。为通过独立方法验证蛰伏诱导效应，本研究利用光遗传学激活 G 神经元：向小鼠注射编码 Cre 依赖性激活性光敏感通道蛋白 ChR2 的 AAV（AAV-DIO-ChR2-mCherry），结果显示体温调控相关蛰伏表型与对照组存在显著差异（附图 4f–k）。综上结果证明，靶向激活 G 神经元足以诱导小鼠出现显著蛰伏。

反复激活 G 神经元可诱导长期蛰伏

单次 CNO 给药诱导的 G 神经元介导蛰伏可持续长达 72 小时且无可见损伤，基于此，本研究探索持续激活该神经元能否将急性蛰伏延长为长时间、稳定的蛰伏状态。研究采用每 48 小时注射一次 CNO、连续 24 天的方案，实现神经元反复刺激（图 3a）。

与对照组相比，G-hM3Dq 小鼠在整个实验期间直肠温度持续被抑制，无自发苏醒或体温回升迹象（图 3b）。体温、T_BAT与代谢指标（VO₂、HEAT、RER）在中期（第 12–14 天）与末期（第 24–26 天）检测中均持续显著受抑（图 3c–f；附图 6a–d）。关键对照实验显示，野生型小鼠反复注射 CNO 未引起体温变化（附图 7a–c），证实持续蛰伏表型特异性归因于 hM3Dq 介导的 G 神经元激活。

为明确长期激活 G 神经元期间摄食量减少是否导致持续蛰伏，本研究对野生型小鼠进行 50% 热量限制，使其摄食量与反复激活 G 神经元的 G-hM3Dq 小鼠相当（附图 6f、7d）。尽管 50% 热量限制在最初三天短暂引起直肠温度轻微下降，但无法建立或维持稳定的长期低体温状态（附图 7f），且伴随严重体重下降，而 G-hM3Dq 小鼠无此现象（附图 6e、7e）。神经元激活与代谢限制在产热响应上的显著差异表明，持续、稳定的长期蛰伏需要直接激活 G 神经元，仅靠热量限制无法实现。上述发现证实，反复化学遗传学激活 G 神经元足以诱导一种全新的、G 神经元驱动的长期蛰伏，命名为GLT，该状态全程稳定，无苏醒或代偿性觉醒现象。

GLT 复苏后小鼠行为能力与组织完整性完好

为评估长时间 GLT 的安全性，本研究在 G-hM3Dq 小鼠完成 26 天 GLT 诱导后，开展全面的行为与生理评估（图 4a）。首先检测 GLT 是否导致行为缺陷，在蛰伏终止后进行一系列标准化行为学检测，包括旷场实验（OFT）、高架十字迷宫（EPM）、悬尾实验（TST）与转棒实验（RR）（图 4a）。四项行为学检测结果显示，G-hM3Dq 小鼠与对照组表现无差异（图 4b–e），证实其探索行为、焦虑相关指标、抑郁样行为与运动协调能力均完好保留。此外，每日监测显示，恢复期内 G-hM3Dq 小鼠体重、摄食量与直肠温度均恢复至基线水平，与对照组无差异（附图 8a–c）。组织学结果与此一致，脂肪组织（皮下白色脂肪组织 sWAT、附睾白色脂肪组织 eWAT、棕色脂肪组织 BAT）、肝脏、骨骼肌、心脏、肾脏与脑组织的形态结构完整，组织重量与对照组无差异（图 4f，附图 8d）。上述观察共同证明，GLT 具有良好的生理耐受性，无 detectable 行为缺陷与组织损伤。

为更全面评估 GLT 的安全性，本研究将其与 avMPA 全神经元激活诱导的蛰伏进行直接对比。既往研究显示，激活 avMPA 全部神经元可诱导急性蛰伏，但反复全神经元激活能否诱导长期蛰伏尚不明确。此外，选择性（G 神经元）与非选择性（全神经元）激活诱导蛰伏的安全性差异尚未被系统比较。为解答上述问题，本研究向野生型小鼠 avMPA 双侧注射在 hSyn 启动子驱动下全神经元表达 hM3Dq 的 AAV（AAV-hSyn-hM3Dq-mCherry），并以仅注射 mCherry 的 AAV 作为对照（附图 9a）。

avMPA-hM3Dq 小鼠单次注射 CNO 可诱导出与既往报道一致、持续超过 48 小时的急性蛰伏表型（附图 9b、c）。反复注射 CNO（每 48 小时一次，连续 24 天）同样可诱导低体温、低代谢的全神经元驱动长期蛰伏（PLT）（附图 9a、d–g）。但与 G-hM3Dq 小鼠不同，avMPA-hM3Dq 小鼠复苏后出现多处缺陷：尽管直肠温度与摄食量恢复至基线，但体重持续下降且无法恢复（附图 9h–j）；行为学检测显示焦虑样表型（旷场中心区域停留时间与路程占比降低、高架十字迷宫开放臂探索减少、悬尾不动时间增加）与运动功能受损（旷场活动量减少、转棒掉落潜伏期缩短；附图 9l–o）。与体重与行为学结果一致，复苏后的 avMPA-hM3Dq 小鼠 eWAT 与腓肠肌重量降低，组织学显示脂滴减少与肌纤维萎缩（附图 9k、p）。

为在分子水平评估全身组织安全性，本研究对 GLT 与 PLT 小鼠的关键组织（BAT、eWAT、肝脏、骨骼肌）进行 RNA 测序（图 4a，附图 9a）。PLT 组小鼠出现显著转录组紊乱，表现为炎症、细胞死亡 / 应激、组织纤维化相关通路与标志物基因过度激活，其中 eWAT 与肝脏受累最严重（附图 10a、b），与宏观组织萎缩与行为缺陷结果吻合。相反，GLT 干预未引发上述病理性转录组响应，GLT 小鼠所有检测组织中相同功能域的表达谱均保持高度稳定（附图 10a、b）。

上述结果证实，GLT 是安全、耐受性良好的生理状态，可保留行为能力、组织完整性与分子稳态。相比之下，avMPA 全神经元激活会引发多器官系统与行为域的继发性病理改变。综上，本研究通过全面分析，凸显了 GLT 独有的安全性。

GLT 抑制肿瘤生长并增强化疗效果

为探究 GLT 能否用于慢性疾病治疗（如直接抗肿瘤干预），本研究利用源自 * Kras^G12D/+:Trp53^fl/fl* 小鼠的原代肺腺癌细胞（KP 细胞），在 G-hM3Dq 小鼠中建立肿瘤模型。移植后第 6 天，各组基线肿瘤体积无差异，此时开始每 48 小时注射 CNO 诱导 GLT（图 5a）。

结果令人意外：GLT 可强效抑制肿瘤进展，对照组肿瘤快速生长，至移植后 24 天达到伦理终点（图 5b）。研究终点时，GLT 处理组肿瘤体积与重量均显著低于对照组（图 5b–d）。肿瘤组织学分析印证宏观结果：对照组肿瘤呈高细胞密度、实体性快速增殖结构，GLT 处理组肿瘤细胞密度显著降低、组织结构紊乱（图 5e）。上述发现证明，GLT 足以抑制肿瘤生长。

本研究进一步探索 GLT 能否增强化疗的抗肿瘤效果，在荷瘤 G-hM3Dq 小鼠中联合 GLT 诱导与临床常用化疗药顺铂（cisplatin, CDDP）给药（图 5f）。首先检测两种剂量顺铂单药的抗肿瘤效果：低剂量顺铂单药对肿瘤生长无明显作用，高剂量顺铂可部分抑制肿瘤（图 5g–j）。随后在 GLT 诱导同时给予两种剂量顺铂。如预期所示，GLT 单药重现强效抑瘤效果；令人惊喜的是，GLT 与化疗联合可拓宽治疗窗：原本无效的低剂量顺铂在 GLT 状态下展现显著抗肿瘤效果，而无 GLT 时该效应不存在（图 5g–j）。此外，GLT 还可增强高剂量顺铂的抗肿瘤效果，表现为 GLT 诱导下肿瘤相对重量降幅显著大于无 GLT 组（图 5i）。肿瘤组织学显示，GLT 联合低剂量顺铂组细胞增殖显著受抑，与体积测量结果一致（图 5j）。

综上结果提示，GLT 既可独立抑制肿瘤生长，又可与化疗协同增强抗肿瘤效果。

讨论

尽管调控急性蛰伏进入的中枢机制日渐清晰，但维持长时间、无损伤低代谢状态所需的神经结构仍未被阐明。本研究鉴定出G 神经元—— 一类以 GCN2 为标记的特异性视前区神经元，该神经元群既是日间蛰伏的必需条件，又足以在小鼠中启动人工蛰伏。反复激活 G 神经元可诱导GLT，即稳定、无害的长期蛰伏（附图 11）。该发现为解析蛰伏神经生物学提供了强大新工具，建立了诱导长期低体温、低代谢状态的专用范式，并在小鼠肿瘤模型中证实其重大治疗潜力。

GCN2 激酶在中枢神经系统中的营养感知与代谢调控功能已被阐明，但 GCN2 表达神经元的生理作用完全未知。本研究发现，G 神经元作为 avMPA 内一类未被表征的 GCN2 表达神经元群，在禁食诱导蛰伏期间被强烈激活，提示其可能参与蛰伏调控。为解析其功能，本研究构建新型Gcn2-Cre 小鼠品系，利用该工具证实化学遗传学沉默 G 神经元可消除禁食引发的低体温与低代谢响应，确认其对日间蛰伏的必要性。该神经元群与既往报道的蛰伏调控神经元（表达 ADCYAP1、ERα 或 VGLUT2 的神经元）大部分相互独立，证实 G 神经元是蛰伏调控网络的全新神经元组分。

除调控日间蛰伏外，化学遗传学激活 G 神经元足以在雌雄小鼠中诱导持续超过 72 小时的显著蛰伏，持续时间显著长于激活其他已知蛰伏调控神经元（QRFP⁸、ADCYAP10、ERα⁹、EP3R¹¹或 VGLUT2⁷表达神经元，持续数小时至 48 小时）。这种更强效的效应提示该神经元群具有独特、关键的作用，可能源于其分子或解剖特征。本研究推测，蛰伏持续时间延长可能与更广泛、更核心的神经支配有关，G 神经元中非共定位的亚群可能调控独特的下游环路，或释放其他蛰伏调控神经元无法触及的特异性分子效应物。解析这些亚群的具体贡献，是未来阐明 G 神经元如何调控如此长时程、高稳定性生理程序的关键方向。

该领域的核心挑战之一，是如何将低体温、低代谢状态延长至急性阶段之外。这一限制可能源于传统神经调控手段的瞬时性，往往无法持续抑制生理活动。本研究在此方面取得突破：G 神经元的强效作用提示，操控该神经元可绕过上述限制，通过反复、低频率干预实现从急性到长期蛰伏的转换。本研究采用每两天注射一次 CNO 的方案，成功诱导GLT—— 稳定的 G 神经元驱动长期蛰伏。不同时间点的体温与代谢检测证实，整个方案期间小鼠持续处于深度低体温与低代谢状态，末期与中期表型无衰减或耐受，进一步证明 GLT 的稳定性，且具备延长持续时间的明显可行性。本研究建立了全新、稳定的长期蛰伏诱导范式，突破了急性模型的固有局限。

蛰伏伴随显著生理改变，因此安全诱导并维持长期蛰伏是临床转化的终极前提。本研究在 GLT 苏醒后开展全面评估，未发现行为缺陷或组织学损伤，小鼠体重与器官重量均维持正常。为进一步证实 GLT 独有的安全性，本研究构建 avMPA 全神经元广泛激活诱导的长期蛰伏（PLT）范式，开展对比分析。尽管 PLT 可成功维持长时间蛰伏且基础生理功能完整，但复苏后引发多项显著损伤，包括特定行为改变与肌肉、eWAT 组织学异常。与此一致，RNA 测序显示 PLT 组出现广泛的全身损伤转录组特征，而 GLT 组无此现象。上述结果提示，尽管广泛激活 avMPA 可诱导类似长期蛰伏，但G 神经元亚群是安全调控的高度精准靶点。PLT 的不良脱靶效应可能源于同时激活非 G 神经元，招募 G 神经元不激活的有害下游环路。综上，靶向 G 神经元通路解决了安全诱导并维持长期蛰伏的核心难题，最大程度减少全身扰动，释放其真正治疗潜力。

GLT 独特的安全性与精准性为慢性疾病治疗开辟新路径。急性蛰伏已被提议用于急性损伤治疗，但长期蛰伏能否用于特定疾病治疗尚不明确。近期研究显示蛰伏可能减缓血液表观遗传衰老，提示其可用于癌症等慢性疾病管理。长时间持续低代谢状态下，细胞增殖显著受抑，而肿瘤细胞的核心特征是失控增殖，因此蛰伏具备抑制肿瘤生长的潜在可能。本研究首次提供直接证据：GLT 单药即可显著抑制肿瘤生长。此外，GLT 联合两种不同剂量顺铂可产生协同抗肿瘤效果，疗效优于任一单药。该策略不仅提升化疗效果，还具备降低剂量依赖性副作用的潜力。尽管本研究证实肿瘤抑制源于全身低体温、低代谢状态，但具体机制仍待未来研究阐明。本研究将 GLT 与化疗联合，显著抑制肿瘤生长，开创了全新的癌症治疗策略。

综上，本研究鉴定出G 神经元—— 一类全新的关键神经元群，可安全介导长期蛰伏，建立了在非冬眠动物中实现这一难以实现状态的新型稳定方法。该突破性工作为未来研究开辟多个重要方向：第一，禁食期间激活 G 神经元的精确上游信号，以及调控蛰伏的下游环路，仍待全面阐明。GCN2 是经典的营养应激感受器，介导外周与中枢系统的代谢响应，本研究推测 avMPA 内 GCN2 作为中枢转换器，将禁食引发的营养匮乏转化为蛰伏所需的神经元激活。第二，尽管本研究数据凸显 GLT 独有的安全性，仍需开展全面长期评估，检测任何潜在、轻微或延迟的全身效应。第三，GCN2 在演化上高度保守，提示靶向同源神经元群可能在其他物种中诱导类似低体温、低代谢状态。未来在大型哺乳动物（尤其是非人灵长类）中开展研究，是评估转化可行性与安全性的关键步骤。最后，解析 GLT 抑制肿瘤生长、增强化疗效果的精确分子机制，可能发现全新生物学靶点。除肿瘤领域外，本研究还凸显 GLT 在其他慢性疾病与病理状态中的广泛应用潜力。

解答上述问题，是将这一安全、持续性低体温低代谢模型转化为变革性治疗策略的关键。

图表注释汇总

图 1 G 神经元受禁食激活且为禁食诱导蛰伏所必需

a–f，野生型小鼠自由进食（Fed）或禁食（Fasting）24 小时后检测神经元活性。a，实验方案。b，核心体温（T_core）与自主活动（Activity）代表性曲线。灰 / 白色区域分别代表 12 小时黑暗 / 光照期。c，d，最低 T_core与代谢率（耗氧量 VO₂）定量（n=3，****p=4.0e-5，****p=1.9e-6）。e，内侧视前区（MPA，前囟：+0.50、+0.38、−0.10 mm）嘴侧、中间、尾侧切片中 GCN2（红色）、Fos（绿色）、NeuN（蓝色）免疫荧光（IF）代表性图像。标尺：主图与放大图均为 100 μm。f，MPA 嘴侧、中间、尾侧 Fos⁺/GCN2⁺/NeuN⁺神经元计数定量（n=4，****p=8.1e-5，***p=2.5e-4，p=0.24）。g–m，禁食期间化学遗传学抑制 avMPA 内 GCN2 表达神经元（G 神经元）。g，实验方案。h，左，CNO 给药后对照组（mCherry）与 G-hM4Di（hM4Di）小鼠 avMPA 切片 Fos（绿色）免疫荧光代表性图像；右，Fos⁺/mCherry⁺共定位神经元计数定量（n=9，****p=3.2e-6）。标尺：主图与放大图均为 100 μm。i，24 小时禁食前后 T_core与自主活动（n=5）。虚线代表 CNO 给药起始点。j，最低 T_core定量（n=5，***p=2.5e-4）。k，基线（0 小时）与禁食 17 小时棕色脂肪组织表面温度（T_BAT）红外热成像代表性图像。l，m，禁食期间最低 T_BAT与 VO₂定量（n=6，***p=3.3e-4，*p=0.019）。

数据以均值± 标准误（SEM）表示。c、d、f、h、i、k、l 采用双侧非配对 t 检验。*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001。

图 2 单独激活 G 神经元即可诱导小鼠进入蛰伏

a，实验方案。b，左，CNO 给药后对照组（mCherry）与 G-hM3Dq（hM3Dq）小鼠 avMPA 切片 Fos（绿色）免疫荧光代表性图像；右，Fos⁺/mCherry⁺共定位神经元计数定量（n=5，***p=1.7e-4）。标尺：主图与放大图均为 100 μm。c，左，CNO 给药前后核心体温（T_core）与自主活动（n=5）；右，给药后最低 T_core定量（n=5，****p=7.9e-7）。灰 / 白色区域分别代表 12 小时黑暗 / 光照期。虚线代表 CNO 给药起始点。d，CNO 给药前后指定时间点棕色脂肪组织表面温度（T_BAT）红外热成像代表性图像。箭头示给药 0.5 小时尾部温度短暂升高，提示皮肤血管舒张。e，左，CNO 给药前后 T_BAT；右，给药后平均 T_BAT定量（n=5，***p=2.3e-4）。f，左，CNO 给药前后代谢率（耗氧量 VO₂）；右，给药后平均 VO₂定量（n=6，***p=5.9e-4）。

数据以均值± 标准误（SEM）表示。b、c、e、f 采用双侧非配对 t 检验。***p<0.001；****p<0.0001。

图 3 反复激活 G 神经元诱导 G 神经元驱动的长期蛰伏（GLT）

a，GLT 诱导与表型检测实验方案。b，对照组（mCherry）与 G-hM3Dq（hM3Dq）小鼠指定时间点直肠温度（n=5，****p=2e-15）。c、d，左，中期（第 12–14 天）棕色脂肪组织表面温度（T_BAT）与代谢率（耗氧量 VO₂）；右，平均 T_BAT与平均 VO₂定量（n=5，****p=3.0e-9，****p=5.8e-9）。灰 / 白色区域分别代表 12 小时黑暗 / 光照期。虚线代表 CNO 给药起始点。e、f，左，末期（第 24–26 天）T_BAT与 VO₂；右，平均 T_BAT与平均 VO₂定量（n=5，****p=7.5e-9，****p=1.1e-8）。

数据以均值± 标准误（SEM）表示。b 采用重复测量双因素方差分析（RM ANOVA）结合 Geisser-Greenhouse 校正；c、d、e、f 采用双侧非配对 t 检验。****p<0.0001。

图 4 G 神经元驱动的长期蛰伏（GLT）后未观察到继发性病理改变

a，GLT 后行为学检测与组织分析实验方案。旷场实验（OFT）、高架十字迷宫（EPM）、悬尾实验（TST）、转棒实验（RR）、苏木精 - 伊红染色（HE）。b，GLT 诱导后对照组（mCherry）与 G-hM3Dq（hM3Dq）小鼠旷场总活动距离（Total distance）、中心区域路程占比（Central distance）、中心区域停留时间占比（Central time）（n=10，p=0.39，p=0.35，p=0.77）。c，高架十字迷宫开放臂进入次数（Number into open arm）与开放臂停留时间（Time in open arm）（n=10，p=0.70，p=0.069）。d，悬尾不动时间（n=10，p=0.43）。e，转棒掉落潜伏期（n=10，p=0.35）。f，皮下白色脂肪组织（sWAT）、附睾白色脂肪组织（eWAT）、棕色脂肪组织（BAT）、肝脏、肌肉、心脏、肾脏、脑组织苏木精 - 伊红染色代表性图像。标尺：sWAT、eWAT、BAT、肌肉、心脏、肾脏、脑组织为 200 μm；肝脏为 400 μm。

数据以均值± 标准误（SEM）表示。b、c、d、e 采用双侧非配对 t 检验。

图 5 G 神经元驱动的长期蛰伏（GLT）抑制肿瘤生长并增强化疗效果

a–e，GLT 直接抑瘤效果。a，实验方案，苏木精 - 伊红染色（HE）。b，移植后第 6–24 天对照组（mCherry，n=14）与 G-hM3Dq（hM3Dq，n=13）小鼠肿瘤体积生长曲线（****p=6e-15）。虚线代表 CNO 给药起始点。c、d、e，移植后 24 天取材肿瘤的代表性图像、重量、苏木精 - 伊红（HE）染色图像（n=10，****p=3.2e-5）。标尺：c、h 为 1 cm；e、j 为 500 μm。f–j，GLT 对化疗的增效作用。f，实验方案。g，移植后第 9–21 天非 GLT 组（不同药物处理：溶剂、1 mg/kg 顺铂（CDDP）、3 mg/kg CDDP；mCherry+con，n=5；mCherry+1mg/kg，n=5；mCherry+3mg/kg，n=6）与 GLT 组（hM3Dq+con、hM3Dq+1mg/kg、hM3Dq+3mg/kg，n=8）肿瘤体积生长曲线（mCherry+con vs mCherry+1mg/kg，p=0.70；mCherry+Con vs mCherry+3mg/kg，****p=1.2e-11；hM3Dq+con vs hM3Dq+1mg/kg，**p=5.4e-3；hM3Dq+con vs hM3Dq+3mg/kg，**p=5.5e-3；mCherry+con vs hM3Dq+con，####p<1e-15；hM3Dq+1mg/kg vs hM3Dq+1mg/kg，####p<1e-15；hM3Dq+3mg/kg vs hM3Dq+3mg/kg，###p<1e-15）。虚线代表药物给药起始点。h、i、j，移植后 21 天取材肿瘤的代表性图像、重量、HE 染色图像。i，上，肿瘤重量；下，mCherry 与 hM3Dq 组肿瘤相对对照组重量（mCherry，n=4；hM3Dq，n=6；mCherry+con vs mCherry+1mg/kg，p=0.72；mCherry+con vs mCherry+3mg/kg，p=0.037；hM3Dq+con vs hM3Dq+1mg/kg，**p=2.4e-4；hM3Dq+con vs h3Dq+3mg/kg，p=3.9e-5；hM3Dq+1mg/kg vs hM3Dq+1mg/kg，##p=7.1e-4；hM3Dq+3mg/kg vs hM3Dq+3mg/kg，#p=0.033）。

数据以均值± 标准误（SEM）表示。d 采用双侧非配对 t 检验；b、g 采用重复测量双因素方差分析（RM ANOVA）结合 Geisser-Greenhouse 校正；i 采用单因素方差分析（Tukey 多重比较）与双因素方差分析（RM ANOVA）结合 Geisser-Greenhouse 校正，后续进行 Bonferroni 校正的非配对 t 检验。/#p<0.05；/##p<0.01；**/###p<0.001；**/####p<0.0001。