H2O2

实时监测与远红成像亚细胞分辨率下的过氧化氢动态变化

Justin Daho Lee¹²³、Amanda Nguyen²、Chelsea E. Gibbs²¹³、Zheyu Ruby Jin⁴¹³、Yuxuan Wang²¹³、Aida Moghadasi²、Sarah J. Wait¹²³、Hojun Choi⁵⁶、Kira M. Evitts²³、Anthony Asencio²³⁷⁸、Samantha B. Bremner²、Shani Zuniga²、Vedant Chavan²、Inez K. A. Pranoto³⁹、C. Andrew Williams³⁹、Annette Smith³、Farid Moussavi-Harami³⁷⁸⁹¹⁰、Michael Regnier²³⁷⁸、David Baker⁵⁶¹¹、Jessica E. Young³⁹、David L. Mack²³¹²、Elizabeth Nance¹²⁴、Patrick M. Boyle²³⁷⁸、Andre Berndt¹²³⁷

《自然・化学生物学》|2026 年 4 月 | 第 22 卷 | 556-567 页

文章链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01891-7

摘要

结合关键生物互作因子监测过氧化氢的动态变化，对于阐明细胞氧化还原调控的生理效应至关重要。搭载 JF635 荧光团的 HaloTag 光遗传学过氧化氢传感器（oROS-HT635）可实现快速、灵敏的化学生物学远红过氧化氢成像，同时克服了现有红色荧光过氧化氢指示剂的诸多缺陷，包括氧依赖性、高 pH 敏感性、光伪影及细胞内聚集等问题。oROS-HT635 与蓝绿波段光学工具的兼容性，使其能对氧化还原生物学展开多样化的光遗传学解析。此外，将 oROS-HT635 靶向表达并结合过氧化氢多重成像技术，可实现质膜及相邻细胞靶向过氧化氢的空间分辨成像。本研究中，我们通过双色成像捕捉抗氧化酶抑制剂金诺芬处理后，细胞内氧化还原电位、钙离子水平与过氧化氢的急性实时变化，证实了 oROS-HT635 与其他绿色荧光报告基因联用的多重应用场景。借助亚细胞分辨率的实时远红过氧化氢成像技术，oROS-HT635 能够深入解析复杂的细胞内及细胞间过氧化氢动态变化，以及其与互作因子间的相互作用。

正文

氧化应激往往是多种疾病进展的关键因素。科研人员已投入大量精力开发靶向氧化剂过量存在及其产生源头的治疗手段。然而，抗氧化治疗的效果不尽如人意，这要求我们更细致地了解细胞内氧化剂、抗氧化防御网络，以及二者对细胞系统的精准调控作用，从而为优化抗氧化治疗策略提供理论依据。过氧化氢是氧化还原生物学中的主要氧化剂，同时也可作为多种细胞信号通路中的多效性第二信使，其表达水平受到严格调控。过氧化氢的前体超氧阴离子是有氧代谢的天然副产物，可通过自发反应或超氧化物歧化酶的作用快速转化为过氧化氢。黄素氧化酶也是过氧化氢的另一重要来源。病理状态下常可观察到过氧化氢的过量累积，且越来越多的证据表明，过氧化氢在疾病进展中发挥着致病作用。基因编码过氧化氢指示剂（GEHI，如基于氧应激调节蛋白的传感器和基于过氧化物酶的传感器）可实现多种生物体系中过氧化氢动态变化的实时监测。考虑到目前已有大量针对生物分子和生理过程的绿色荧光传感器（如钙离子、pH、膜电位、氧化还原电位等传感器），红色荧光基因编码过氧化氢指示剂能够结合其他关键生物分子或生理过程，对过氧化氢的动态变化进行多参数分析。尽管如此，现有红移型（red-shifted）基因编码过氧化氢指示剂的动力学特性较慢，这成为实时过氧化氢成像的一大瓶颈。最重要的是，基于红色荧光蛋白的传感器常存在蓝光诱导的光致变色伪影，当与绿色荧光传感器联用时，会在多色成像中产生假信号。最后，红色荧光蛋白还存在聚集倾向且亮度较低的问题，这进一步降低了现有红移型基因编码过氧化氢指示剂的实用性。

氧应激调节蛋白是一种细菌转录激活因子，对过氧化氢具有高度的特异性和敏感性，且过氧化物酶活性较低，即该蛋白对过氧化氢敏感但催化活性有限。现有的红移型基因编码过氧化氢指示剂（如 HyPerRed 和 SHIRMP）均以大肠杆菌氧应激调节蛋白的配体结合域作为传感结构域。但这两种红色荧光指示剂的动力学特性均慢于大肠杆菌氧应激调节蛋白本身的固有动力学和敏感性，具体表现为饱和条件下完全激活需 10-100 秒，还原过程则需 30 分钟，而大肠杆菌氧应激调节蛋白的氧化过程在亚秒级完成，还原过程仅需 5-10 分钟。我们推测，在现有红移型基因编码过氧化氢指示剂中，荧光报告结构域的插入可能减缓了大肠杆菌氧应激调节蛋白的激活与失活过程。本研究中，我们将细菌氧应激调节蛋白过氧化氢传感器与基于罗丹明 - HaloTag 的化学生物学报告系统相结合，开发出一种过氧化氢远红指示剂，命名为搭载 JF635 荧光团的 HaloTag 光遗传学过氧化氢传感器（oROS-HT635）。我们基于实验解析结构和计算模型（ColabFold）的结构信息，设计了合理的工程化改造策略，获得了亮度高、响应快的远红传感器，可高灵敏度地观察细胞内过氧化氢的扩散过程。此外，oROS-HT635 无光学致变色伪影，可对过氧化氢的动态变化进行多色情境分析。作为概念验证，我们揭示了抗炎药金诺芬（auranofin）对人胚肾 293 细胞内过氧化氢水平及细胞氧化还原电位的急性影响，以及对人诱导多能干细胞来源心肌细胞内钙离子水平的调控作用。这些实验更精准地建立了不同生理现象间的时空关联。最后，我们提出了化学生物学和光遗传学方法，可可视化线粒体和质膜外侧产生的过氧化氢向质膜内侧及相邻细胞的位点特异性生成与扩散过程。

结果

工程化改造开发高亮度过氧化氢远红化学生物学传感器

我们的工程化改造策略旨在维持传感结构域（即大肠杆菌氧应激调节蛋白配体结合域）中驱动构象变化的蛋白环的柔性，这一策略在我们此前开发基于绿色荧光蛋白的 oROS-G 传感器时已得到验证。具体而言，大肠杆菌氧应激调节蛋白含有一个疏水口袋，构成了与过氧化氢相互作用的活性中心。结合过氧化氢后，其会与相邻氨基酸残基形成氢键网络，使 199 位和 208 位半胱氨酸残基靠近并形成二硫键。通过分析大肠杆菌氧应激调节蛋白配体结合域结构的 B 因子，我们发现在 199-208 位区域（图1a）存在明显的高柔性峰值。我们认为，维持该区域的柔性是过氧化氢高效激活氧应激调节蛋白的必要条件。因此，如 HyPerRed 中那样在 199 位和 208 位半胱氨酸之间插入体积较大的荧光报告结构域，可能是导致氧应激调节蛋白激活减慢的原因，为此我们探索了该区域外的其他插入位点（图1b）。

此外，红色荧光蛋白在光学多色分析或神经元表达的多样化应用中存在诸多挑战。例如，HyPerRed 中使用的环排列型 mApple 荧光蛋白，会在激发绿色荧光蛋白的常用蓝光（如 488nm）诱导下产生假阳性光致变色伪影，且在神经元中易发生聚集。Deo 等人提出了一种设计光遗传学传感器的化学生物学解决方案，即整合可与罗丹明类 JF 荧光团不可逆结合的自标记酶 HaloTag。红移至远红波段的 JF 荧光团具有优异的光物理特性，其亮度和光稳定性均优于现有红色荧光蛋白。我们旨在利用结合远红荧光团 JF635 的环排列型 HaloTag 作为报告结构域，开发一类新型基因编码过氧化氢指示剂。

我们将环排列型 HaloTag 插入大肠杆菌氧应激调节蛋白 199-208 位半胱氨酸环外的多个位点，结果显示，与 205-206 位插入的突变体相比，大肠杆菌氧应激调节蛋白对 300μM 过氧化氢的响应显著加快，这表明不同的结构域插入策略可改善传感器的动力学特性。我们筛选到一个在 213-214 位插入的原型传感器突变体，其对 300μM 过氧化氢脉冲刺激具有强烈响应（荧光变化率∆F/F0：-38.29%；95% 置信区间 CI=-40.44~-36.19；5%-95% 响应时间：4.05 秒；95% 置信区间 CI=3.72~4.42）（图1c，d）。有趣的是，我们发现除 199-208 位半胱氨酸环外，所有环排列型 HaloTag 插入位点的突变体对过氧化氢均表现出反向响应，即过氧化氢水平升高会导致荧光强度降低。因此，我们基于 ColabFold（结合多序列比对工具 MMseqs2 的 AlphaFold2）预测的结构，重点对传感器的亮度进行优化。该预测获得了 213-214 位插入突变体的高置信度结构，其传感结构域的二聚体界面与晶体学解析的还原态大肠杆菌氧应激调节蛋白的二聚体界面高度相似。我们将蛋白质数据库（PDB）中编号 6U2M 的环排列型 HaloTag-JF635 结构进行叠合，确定了 JF635 在 213-214 位插入突变体传感结构域中的假定结合位置。预测结果显示该结构域为 “暴露型” 定位，氧应激调节蛋白传感结构域远离 JF635，而非包裹 JF635 荧光团（图1e），这使得结构域间连接区对荧光团局部微环境的潜在影响增大。该空间构象与化学生物学钙离子指示剂 HaloCaMP1b 的构象一致。

因此，对结构域间连接区残基进行随机突变（XX - 环排列型 HaloTag-X，X 为突变靶点）会同时影响传感器的亮度和动态范围（图1f）。从连接区突变体文库中，我们筛选到一个突变体（TG - 环排列型 HaloTag-R），与 213-214 位插入的原型突变体相比，其静息亮度提高 8.9 倍，300μM 过氧化氢诱导的动态范围提升 27%（213-214 位突变体的标准化亮度：1.00，95% 置信区间 CI=0.89~1.14；TG - 环排列型 HaloTag-R 的标准化亮度：8.93，95% 置信区间 CI=7.29~10.63；213-214 位突变体的标准化荧光变化率∆F/F0：-1.0（样本量 n=1468），95% 置信区间 CI=-1.04~-0.96；TG - 环排列型 HaloTag-R 的动态范围：-1.27（样本量 n=2668），95% 置信区间 CI=-1.27~-1.26），该突变体后被命名为 oROS-HT635（图1g）。

除了从结构上推测结构域间连接区对传感器动力学和亮度的影响外，我们还发现 209 位苯丙氨酸残基是调控荧光团局部微环境的潜在突变位点，最暗突变体（F209L）与最亮突变体（F209R）的静息亮度相差三倍以上，且当传感器与 JF585 配体结合时，该趋势仍保持一致。遗憾的是，TG - 环排列型 HaloTag-R 与 F209R 的突变效应无协同作用，因此我们在最终的传感器突变体中剔除了 F209R 突变。

图 1 基于结构设计的 oROS-HT635：用于过氧化氢的明亮远红光学遗传传感器

a. 氧化态大肠杆菌氧应激调节蛋白（ecOxyR）调控域的 B 因子（PDB ID：1I6A）分布，红色代表柔性区域，蓝色代表刚性区域。

b. ecOxyR 调控域氧化态（PDB ID：1I6A）和还原态（PDB ID：1I69）晶体结构中 195~220 位氨基酸残基的两两间距（灰色线），反映过氧化氢结合引发的分子内动态变化；同时展示氧化态 ecOxyR 调控域 195~220 位残基的平均 B 因子（黑线），虚线标注 C199 和 C208 位残基；红色和品红色柱分别表示 HyPerRed 中荧光报告域（环状排列的 mApple）和 oROS-HT 中荧光报告域（环状排列的卤素标签，cpHaloTag）的插入位点。

c. oROS-HT635 原型变体的筛选结果：在 ecOxyR 的 211~214 位残基间插入 cpHaloTag（来自 HaloCaMP1a 的 cpHaloTag7），检测 HEK293 细胞中各变体在外源 300 μM 过氧化氢刺激下的荧光变化率（∆F/F0）。

d. 图 c 中各变体的动力学特征，以荧光变化达到 5% 至 95% 的时间（秒）表示。

e. 预测的 oROS-HT 结构中，与 cpHaloTag 结合的 JF635 染料的推定结合位置；将 213~214 位插入 cpHaloTag 的变体预测结构与 cpHaloTag 晶体结构（PDB ID：6U2M）叠加，确定 JF635 在该变体上的相对位置（灰色：cpHaloTag；米色：OxyR；橙色：连接子；品红色：JF635 - 卤素标签配体）。

f. HEK293 细胞中域间连接子（X-cpHaloTag-XX）的随机突变筛选结果；上图：各传感器变体的归一化亮度（以 213~214 位变体亮度为 1.0）；下图：300 μM 过氧化氢刺激下各传感器变体的归一化荧光变化率（以 213~214 位变体为 - 1.0），各变体的统计信息见补充表 1（品红色：oROS-HT；深灰色：211~212 位变体；虚线：211~212 位变体的均值）。

g. HEK293 细胞中表达的 oROS-HT 的光谱特征，实线为激发光谱（峰值：640 nm），虚线为发射光谱（峰值：650 nm）。

注：图中误差棒和误差带为基于 1000 次自助法的均值 95% 置信区间，采用 Seaborn v0.13.2 统计绘图包计算。

高灵敏度、快响应、高亮度的过氧化氢远红传感器

我们首先通过向表达 oROS-HT635 的细胞外源性添加过氧化氢，以及加入可诱导细胞内过氧化氢生成的甲萘醌，对 oROS-HT635 的特性进行表征。甲萘醌可通过多种氧化还原循环机制生成过氧化氢。300μM 过氧化氢可使 oROS-HT635 的响应达到饱和，且其激活过程在亚秒级完成，能够捕捉到细胞外过氧化氢在成像视野中的扩散过程，这表明在该实验条件下，传感器的动力学效率已突破反应限制的瓶颈。有趣的是，10μM 细胞外过氧化氢可使 oROS-HT635 的荧光变化率达到 - 58.69%（95% 置信区间 CI=-59.18~-58.18），为 300μM 过氧化氢饱和处理下荧光变化率（-67.27%，95% 置信区间 CI=-67.64~-66.91）的 87%，这表明该传感器具有优异的灵敏度，优于此前报道的红色荧光基因编码过氧化氢指示剂。已有研究表明，在上述外源性过氧化氢处理条件下，人胚肾 293 细胞内的过氧化氢浓度分别约为 10nM 和 300nM。此外，我们以细胞外过氧化氢的梯度浓度为灵敏度基准，发现 oROS-HT635 的灵敏度高于红色荧光指示剂 HyPerRed 和绿色荧光指示剂 HyPer7（图2a）。

我们还利用 oROS-HT635 监测了 10μM、20μM 和 50μM 甲萘醌诱导的人胚肾 293 细胞内过氧化氢的梯度水平，其荧光变化率分别为 - 26.8%（95% 置信区间 CI=-27.63~-25.98）、-59.59%（95% 置信区间 CI=-60.48~-58.67）和 - 63.06%（95% 置信区间 CI=-63.59~-62.51）。有趣的是，50μM 甲萘醌处理下，oROS-HT635 的荧光振幅接近最大值，但其响应速率远慢于 300μM 外源性过氧化氢诱导的瞬时饱和响应，这一动力学特征更能真实反映甲萘醌诱导的细胞质过氧化氢水平的实时升高过程。

此外，在 300μM 过氧化氢饱和处理下，oROS-HT635 的响应动力学显著快于 HyPerRed（荧光变化率 5%-95% 的响应时间：oROS-HT635 为 2.11 秒，95% 置信区间 CI=1.85~2.37；HyPerRed 为 25.22 秒，95% 置信区间 CI=22.5~28.37）（图2b）。以往关于细胞内过氧化氢的实验研究往往假设其浓度在细胞内均匀分布，但此前的细胞质过氧化氢模型表明，外源性过氧化氢刺激后，哺乳动物细胞内会出现过氧化氢的空间梯度分布。oROS-HT635 优异的动力学特性，使其能够以亚细胞分辨率捕捉到人诱导多能干细胞来源心肌细胞在 300μM 过氧化氢脉冲刺激下，细胞内过氧化氢的扩散过程（图2c）。

接下来，我们检测了传感器在细胞内表达的亮度，因为已有多项研究表明传感器的体外亮度与细胞内亮度存在差异。我们将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）融合在两种传感器的 C 端，作为荧光输出的参考。利用配备白光激光器的共聚焦显微镜，在可见光谱范围内进行波长扫描，该检测系统的光子计数准确，死时间极短。我们将传感器还原态和氧化态的光子计数归一化至融合的增强型绿色荧光蛋白参考信号，以测定各传感器的细胞内亮度。重要的是，我们以相同的激光功率（49μW，图2d）激发增强型绿色荧光蛋白、HyPerRed 和 oROS-HT635。基于归一化光子计数结果，oROS-HT635 最暗的氧化态亮度约为 HyPerRed 最亮的还原态亮度的 20 倍（图2f）。此外，oROS-HT635 的发射光谱更窄，更适合多色成像中的高效光谱分离，其半高全宽约为 34nm，而 HyPerRed 的半高全宽约为 104nm（图2g）。同时，oROS-HT635 的量子产率（0.216）高于现有远红荧光蛋白。

oROS-HT635 可在多种哺乳动物组织（如原代大鼠皮质神经元、离体大鼠脑组织）和人干细胞来源模型（如心肌细胞、皮质神经元，图2h）中稳定表达，且在细胞内表达时未观察到明显的聚集现象，而这一现象在基于红色荧光蛋白的指示剂中较为常见。有序光滑内质网（OSER）实验表明，oROS-HT635 的单体化水平高于 HyPerRed。最后，通过连续的过氧化氢刺激和洗脱，oROS-HT635 可反复被激活并还原至基线水平，表明该传感器具有可逆性，能够追踪细胞内过氧化氢水平的实时波动。

图 2 oROS-HT635 的表征：一款明亮、灵敏且快速的过氧化氢传感器

a. 利用细胞外过氧化氢梯度滴定，对 oROS-HT635、HyPer7 和 HyPerRed 进行灵敏度基准测试；各传感器在 HEK293 细胞中表达，荧光响应（∆F/F0）按所有过氧化氢浓度下的最大响应值进行标度（每个浓度 / 传感器的检测细胞数＞100，共 3 个孔）。

b. oROS-HT635 和 HyPerRed 对外源 300 μM 过氧化氢的归一化响应（每种传感器检测 23 个细胞）；插图为荧光变化达到 5% 至 95% 的时间（秒）。

c. 以 20 帧 / 秒的帧率，捕捉人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPS cell-CMs）在外源 300 μM 过氧化氢处理后，细胞质内过氧化氢的扩散过程；左图：图像序列中对传感器激活达 50% 及以上的像素进行布尔门控，增强过氧化氢扩散的对比度（比例尺：50 μm）；右图：反映逐像素激活时间（秒）的扩散图谱。

d. 以融合在过氧化氢传感器 C 端的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为参照，评估传感器的相对细胞亮度。

e. 各传感器发射窗口（10 nm 带宽）的光子计数，均归一化为同一次检测中融合 eGFP 的光子计数；“还原态” 为传感器静息状态的光子计数，“氧化态” 为 300 μM 过氧化氢刺激后的光子计数，为提升视觉对比效果对比值进行对数转换（每个构建体设 4 个孔，每孔采集 3 张图像）。

f. 图 e 中各串联融合变体在最亮状态下的代表性原始图像（图像尺寸：775 μm×775 μm）。

g. 各传感器的定量发射光谱（从各自发射峰开始），均归一化为融合 eGFP 的光子计数（红色：HyPerRed；品红色：oROS-HT635；天蓝色插图：HyPerRed-eGFP 光谱放大图；每种传感器检测细胞数＞100，共 3 个孔）；虚线标注 oROS-HT635 和 HyPerRed 光谱的半高处宽度，据此推算半高全宽（FWHM）。

h. oROS-HT635 在原代皮质神经元（primary-CN）、离体大鼠脑片（brain slice）和人诱导多能干细胞来源的皮质神经元（hiPS cell-CN）中的表达，及其对外源 300 μM 过氧化氢的响应（比例尺：100 μm）。

注：图中误差棒和误差带为基于 1000 次自助法的均值 95% 置信区间，采用 Seaborn v0.13.2 统计绘图包计算。

环境稳定性优异的实时过氧化氢成像

我们设想研究人员可利用 oROS-HT635 在不同条件下研究过氧化氢的动态变化，因此进一步表征了 oROS-HT635 的环境耐受性特征。已有研究表明，与化学过氧化氢示踪剂相比，基于大肠杆菌氧应激调节蛋白的过氧化氢传感器对过氧化氢具有更高的特异性，这一特异性源于其配体结合口袋中独特的氢键网络，该网络可诱导两个高度保守的半胱氨酸残基（大肠杆菌氧应激调节蛋白调控结构域的 199-208 位半胱氨酸）形成过氧化氢特异性的二硫键。与此前的研究结果一致，C199S 突变可阻断二硫键的形成，从而消除过氧化氢诱导的荧光响应（功能缺失），这表明 oROS-HT635 对过氧化氢的响应具有特异性。

尽管如此，荧光信号本身易受 pH 变化、光吸收和自发荧光干扰等环境因素的影响。作为阴性对照，oROS-HT635-C199S 突变体的荧光信号可反映非过氧化氢传感引起的环境因素对荧光的影响。与红色荧光过氧化氢传感器 HyPerRed 相比，oROS-HT635 对 pH、光伪影、聚集和氧等环境因素的耐受性显著提升。我们观察到细胞外表达的 oROS-HT635 的荧光变化具有 pH 依赖性（图3a），但细胞内表达的 oROS-HT635 与 HyPerRed 相比，pH 耐受性明显更优（图3b）。

红移型基因编码过氧化氢指示剂与绿色传感器联用时，常因蓝光诱导的光致变色假阳性伪影而限制其多色应用，而 oROS-HT635 无此伪影，与绿色报告基因的兼容性更强（图3c）。为验证其双色成像能力，我们将 oROS-HT635 或 oROS-HT635-C199S 与基于绿色荧光蛋白的 pH 指示剂 SypHer3s 共表达，可同时成像过氧化氢和 pH 的变化。细胞外 pH 胁迫（pH6 和 pH9）可引起细胞质 pH 的相应变化，这一点可通过 SypHer3s 的响应得到证实，而 oROS-HT635-C199S 的荧光信号未受影响（图3d）。我们随后检测了 oROS-HT635 在酸性 pH 胁迫（pH6）下的功能维持情况，结果显示，oROS-HT635 对初始的 pH 变化无响应（SypHer3s 的响应可证实 pH 发生变化）（图3e），但仍能检测到甲萘醌诱导的细胞质过氧化氢水平升高，这表明该传感器在细胞 pH 环境变化时仍具有稳定的功能。

传感器设计中使用的大多数β 桶型荧光蛋白，其荧光团的成熟过程需要氧气参与，且绿色荧光蛋白在低氧条件下会发生光转换，其激发 / 发射光谱发生偏移，与红色荧光蛋白的光谱相似。相比之下，基于 HaloTag - 罗丹明的化学生物学传感器整合了合成荧光团，其荧光特性不依赖于氧气。转染 oROS-HT635-C199S 的人胚肾 293 细胞在常氧和低氧条件下的荧光信号无显著差异（图3f）。

图 3 oROS-HT635 在不同环境条件下的生物物理特性和多功能性

a. 利用 pDisplay-oROS-HT635 实现传感器的细胞外表达，通过不同培养基配方设置不同 pH 条件并检测荧光强度；荧光强度以 pH 7.44 时的强度为基线进行归一化（虚线标注，检测 36 个细胞，共 3 个孔）。

b. HEK293 细胞中表达的胞质型功能缺失突变体 oROS-HT635-C199S 和胞质型 HyPerRed-C199S，在细胞外 pH 为 9 或 6 时的荧光变化率（∆F/F0，%）。

c. oROS-HT635 和 HyPerRed 在各自激发波长（635 nm 和 597 nm）下，以及对 488 nm 蓝光脉冲的代表性荧光发射特征。

d. HEK293 细胞中共同表达 oROS-HT635-C199S 和绿色荧光 pH 指示剂 SypHer3s 的多色成像；在灰色竖线处将中性成像液（pH 7.44）替换为酸性（pH 6，检测 22 个细胞）或碱性（pH 9，检测 47 个细胞）成像液。

e. HEK293 细胞中 pH 和过氧化氢的双重监测；将 oROS-HT635 或其功能缺失突变体 oROS-HT635-C199S 与绿色荧光 pH 指示剂 SypHer3s 配对，监测（1）pH 环境变化（pH 6）和（2）10 μM 甲萘醌诱导的过氧化氢升高（每个条件检测细胞数＞100，共 3 个孔）。

f. 缺氧条件下 oROS-HT635-C199S 的荧光成熟特性；将表达功能缺失突变体 oROS-HT635-C199S 的 HEK293 细胞分别在常氧（Norm.：37℃大气环境）或缺氧（Hypo.：37℃氮气灌注培养箱）条件下孵育过夜（18 h）；左图：常氧和缺氧条件下 HEK293 细胞中 oROS-HT635-C199S 成熟的代表性图像（比例尺：100 μm）；右图：oROS-HT635-C199S 的荧光强度分布（缺氧组：1246 个细胞，8 个孔；常氧组：1765 个细胞，11 个孔）。

注：图中误差棒和误差带为基于 1000 次自助法的均值 95% 置信区间，采用 Seaborn v0.13.2 统计绘图包计算；箱线图展示中位数、四分位距（IQR）、延伸至 1.5×IQR 的须状线及离群值；f 图采用双侧独立 t 检验分析，NS 表示无统计学差异，AU 为任意单位。

金诺芬对人胚肾细胞过氧化氢水平和谷胱甘肽氧化还原电位的急性影响

谷氧还蛋白 1 - 氧化还原敏感型绿色荧光蛋白 2（GRX1–roGFP2）是一种对谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）敏感的指示剂，由谷氧还蛋白 1（GRX1）与氧化还原敏感型绿色荧光蛋白 roGFP2 融合而成。将 oROS-HT635 与 GRX1–roGFP2 联用进行多重成像，可在成像过氧化氢的同时，获得更多细胞氧化还原微环境的信息。我们在人胚肾 293 细胞中同时监测两种传感器对 10μM 过氧化氢的响应，结果观察到细胞内过氧化氢水平先升高，随后谷胱甘肽氧化还原电位降低，两个峰值的时间间隔为 3.12 秒（图4a）。

相比之下，使用硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的选择性抑制剂金诺芬（1μM）降低细胞的抗氧化能力时，谷胱甘肽氧化还原电位会快速降低，随后细胞内过氧化氢水平缓慢升高。有趣的是，金诺芬诱导的过氧化氢累积具有瞬时性（图4b），其水平的逆转可能由应激诱导的抗氧化反应增强所触发。我们观察到，人胚肾 293 细胞在 1μM 金诺芬处理 30 分钟内（图4c），核因子 E2 相关因子 2（NRF2）向细胞核的转位增加，而核因子 E2 相关因子 2 的转位是细胞快速启动抗氧化反应的标志，与此前的研究结果一致，这些研究证实核因子 E2 相关因子 2 可在 10 分钟至 1 小时内快速转位至细胞核。因此我们认为，核因子 E2 相关因子 2 触发了细胞的抗氧化反应，进而逆转了药物诱导的过氧化氢水平升高。将 GRX1–roGFP2 与 oROS-HT635 联用，建立了过氧化氢水平与细胞氧化还原微环境间的时空关联。

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中过氧化氢与钙离子的瞬时变化

越来越多的证据表明，生物体系中氧化还原与钙离子的动态变化存在相互作用，但现有的分子成像工具仅能对生物体系中钙离子和过氧化氢的变化进行异步研究，而同步检测能更精准地建立这两种生理现象间的时空关联。利用 oROS-HT635 对过氧化氢进行多色检测，可在同一细胞中同时实时观察氧化应激和钙离子的变化，且其时间分辨率足以捕捉到钙离子的瞬时变化（CaTs）。本研究中，我们将 oROS-HT635 与钙离子敏感型绿色荧光染料 Fluo-4 联用，对人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的过氧化氢和钙离子瞬时变化进行双色成像（图4d）。目前公认的是，氧化应激会干扰兰尼碱受体（肌浆网钙离子渗漏）、L 型钙离子通道（内向钙离子电流）和肌浆网钙离子 ATP 酶泵（SERCA，钙离子重摄取减少）等关键钙离子转运体的功能，这些功能扰动可导致钙离子瞬时变化的特定表型改变，如基线钙离子水平、钙离子瞬时变化振幅、达峰时间（TtP，上升动力学）和钙离子瞬时变化 90% 持续时间（CaTD90，单次钙离子瞬时变化完成 90% 的时间）。

我们检测了金诺芬诱导的急性氧化应激对钙离子动态变化的扰动作用，已有研究报道金诺芬可诱导部分细胞类型的钙离子水平升高。实验结果显示，在 20 分钟的成像时间内，5μM 金诺芬可诱导过氧化氢（图4e）水平升高，同时伴随基线钙离子（图4f）水平上升。我们随后从 Fluo-4 的成像数据中提取钙离子瞬时变化的特征曲线进行进一步分析（图4h），与溶媒对照组相比，金诺芬处理的人诱导多能干细胞来源心肌细胞的钙离子瞬时变化表现出以下表型：钙离子瞬时变化的峰值振幅升高，达峰时间和 90% 持续时间延长（图4i）。

图 4 金诺芬对过氧化氢、氧化还原电位和钙离子的急性作用的多参数分析

a~c. 细胞内谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）和过氧化氢的双重监测

a. HEK293 细胞中共同表达 GRX1–roGFP2（绿色，EGSH 传感器）和 oROS-HT635（品红色），在 10 μM 过氧化氢刺激下（灰色线处）的归一化荧光变化（检测细胞数＞100，共 3 个孔），Ex 表示激发波长。

b. HEK293 细胞中，金诺芬诱导的 GRX1–roGFP2 和 oROS-HT635 的响应曲线；oROS-HT635 的响应（品红色）以相对于基线的荧光变化率（F/F0）表示，GRX1–roGFP2 的响应（绿色）以 405/488 nm 激发的荧光强度比表示；各传感器图中的虚线为溶媒对照组的响应（每个条件检测细胞数＞100，共 3 个孔），AUR 表示金诺芬组，VEH 表示溶媒对照组。

c. HEK293 细胞暴露于 1 μM 金诺芬 30 min 后，核因子 E2 相关因子 2（NRF2）的核 / 核周比值定量结果（免疫荧光染色法，每个条件检测细胞数＞100，共 5 个孔），详细分析方法见补充图 8。

d~i. 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPS cell-CMs）中钙离子和过氧化氢的双成像（金诺芬组 n=12，溶媒对照组 n=11；每个孔选取多个感兴趣区域，共 3 个孔）

d. 代表性响应曲线，黑色圆点标注钙瞬变（CaT）峰值，红色叉号标注谷值。

e. oROS-HT635 的荧光变化率（F/F0）。

f. Fluo-4 的静息荧光变化（∆Baseline）。

g. 钙瞬变随时间变化的代表性曲线。

h. 钙瞬变表型的示意图，Cai 表示细胞内钙离子浓度。

i. 提取的钙瞬变表型；左图：峰值振幅；中图：达峰时间（TtP）；右图：钙瞬变 90% 衰减时间（CaTD90）。

* 注：图中误差棒和误差带为基于 1000 次自助法的均值 95% 置信区间，采用 Seaborn v0.13.2 统计绘图包计算；箱线图展示中位数、四分位距（IQR）、延伸至 1.5×IQR 的须状线及离群值；c、e、f、i 图采用双侧独立 t 检验分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001。

氧化应激对人诱导多能干细胞来源心肌细胞钙离子瞬时变化影响的建模分析

我们采用此前报道的人诱导多能干细胞来源心肌细胞电生理学“通用” 计算模型，探究氧化应激导致上述钙离子瞬时变化表型（振幅升高、达峰时间和 90% 持续时间延长）的作用机制。结合此前报道的氧化应激对钙离子转运体的影响，我们通过修改肌浆网钙离子 ATP 酶介导的细胞质钙离子向肌浆网的摄取、肌浆网钙离子渗漏振幅和 L 型钙离子通道电导的相关参数，对氧化应激进行建模。结果显示，扰动肌浆网钙离子渗漏对钙离子瞬时变化的特征曲线无影响，而修改 L 型钙离子通道和肌浆网钙离子 ATP 酶的相关参数可引起钙离子瞬时变化的改变（图5a-c）。

因此，我们进行双变量分析以确定钙离子瞬时变化表型与肌浆网钙离子 ATP 酶和 L 型钙离子通道水平的相关性，结果表明，只有对两者进行协同扰动建模时，才能得到与实验观察一致的钙离子瞬时变化表型（图5d）。总体而言，钙离子瞬时变化的特征曲线对 L 型钙离子通道的变化比肌浆网钙离子 ATP 酶更敏感（图5e），这与此前的研究结果一致—— 由于肌浆网相关钙离子转运体的功能不成熟，L 型钙离子通道是人诱导多能干细胞来源心肌细胞钙离子瞬时变化的主要驱动因素。

图 5 L 型钙通道和肌浆网钙 ATP 酶的相互作用模型揭示氧化应激诱导的钙离子稳态失调

a~c. 利用经改良的 hiPS cell-CM 计算模型（Kernik 等，2019），模拟氧化应激诱导的 L 型钙通道（ICaL）电导（a）、肌浆网钙 ATP 酶（SERCA）摄取（b）和肌浆网（SR）钙泄漏（c）扰动的效应；总模拟时间 = 100 s，基线搏动频率校准为 0.5 Hz 以匹配实验数据，图中展示各模拟条件下稳态时的细胞质钙瞬变曲线，红色虚线为无扰动的模拟结果。

d. 协同作用图谱，展示各模拟条件下钙瞬变表型与无扰动条件的差异程度（∆表型 / 表型 1.0），表型 1.0 位于红色点状边界内；黑色点状边界内的网格框表示，其表型变化趋势（升高 / 降低）与图 4d~i 中观察到的钙瞬变表型（∆静息值、∆振幅、∆达峰时间、∆90% 衰减时间）一致。

e. 钙瞬变影响图谱（ICaL 与 SERCA 的相互作用），由各表型绝对影响值（|∆表型 / 表型 1.0|，包括∆静息值、∆振幅、∆达峰时间、∆90% 衰减时间）的加权和得出；ICaL 和 SERCA 的协同扰动足以重现实验中观察到的钙瞬变表型。

然而，建模扰动后的稳态搏动频率在 0.479-0.846Hz 之间，且有加快的趋势，这与实验结果一致 —— 在三个重复实验中，金诺芬在两个实验组中使心肌细胞的搏动频率加快。为验证观察到的钙离子瞬时变化表型改变源于参数修改而非固有搏动频率的变化，我们通过超速起搏将基线模型（0.5Hz）起搏至 0.85Hz，进行额外的模拟实验，结果仅导致钙离子瞬时变化指标发生微小或反向改变（起搏使钙离子瞬时变化振幅降低，而氧化应激模拟扰动使振幅升高）。

因此，尽管人诱导多能干细胞来源心肌细胞的钙离子瞬时变化表型对 L 型钙离子通道的变化更敏感，但只有同时对质膜和肌浆网的相关组分进行协同扰动，才能重现实验观察到的钙离子瞬时变化表型。换言之，L 型钙离子通道和肌浆网钙离子 ATP 酶的协同扰动足以模拟出实验观察到的表型变化。这些结果表明，氧化应激对心肌细胞钙离子动态变化的影响具有复杂性，进一步强调了需要系统性研究氧化应激对特定钙离子转运体的影响及其协同作用。

甲萘醌诱导的细胞内和细胞外过氧化氢成像

在好氧生物中，细胞内过氧化氢的生成具有潜在的定位特异性和功能差异性，因此需要以空间分辨的方式监测过氧化氢的变化（如在亚细胞区室中）（图6a）。越来越多的证据表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶来源的超氧阴离子和过氧化氢在氧化还原信号传导和疾病进展中发挥重要作用，该氧化酶在细胞质膜的细胞外侧生成过氧化氢，形成细胞外的过氧化氢池。此外，过氧化氢可通过自分泌（水通道蛋白介导的过氧化氢向细胞内扩散）和旁分泌机制实现细胞内的分布。

我们将 oROS-HT635 与基于血小板衍生生长因子受体跨膜结构域的靶向序列（pDisplay 载体，英杰公司）融合，实现其在细胞质膜外侧的定位，该融合蛋白与我们此前开发的灵敏度高、响应速率相当的绿色荧光版 oROS-G 传感器在人胚肾 293 细胞中共表达时（图6b），相容性良好。25μM 甲萘醌处理后，我们检测到细胞外和细胞内的过氧化氢水平均升高，有趣的是，在两种传感器均对甲萘醌产生响应的细胞中，基于 oROS-HT635 检测到的细胞外过氧化氢响应速率快于 oROS-G，这与此前的观察结果一致，即甲萘醌可通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导的途径升高细胞外的过氧化氢水平（图6c，d）。

图 6 过氧化氢的时空分辨成像

a. oROS-HT635 的亚细胞定位：通过融合肽序列实现肌动蛋白（LifeAct）、线粒体基质（dMito）、线粒体膜间隙（IMS）和质膜内侧（CAAX）的靶向定位；利用共聚焦显微镜对表达各靶向变体的 HEK293 细胞进行活细胞成像（比例尺：10 μm）。

b. HEK293 细胞中共同表达 pDisplay-oROS-HT635（质膜外侧）和胞质型 oROS-G 的示意图及共聚焦 Z 轴堆叠图像（比例尺：10 μm）。

c~d. 利用落射荧光显微镜，检测表达 pDisplay-oROS-HT635 和胞质型 oROS-G 的 HEK293 细胞在 25 μM 甲萘醌刺激下的荧光变化，两种传感器每秒成像一次；c. 单个细胞中 oROS-HT635 和 oROS-G 的代表性响应曲线；d. 传感器激活达 50% 的时间（秒，检测 25 个细胞，4 次生物学重复）。

e. 化学遗传学诱导的线粒体过氧化氢向线粒体基质、膜间隙和质膜内侧扩散的激活动力学（3 次生物学重复，5% 至 95% 荧光变化的时间以均值 ± 标准差表示）；向表达 dMito-DAAO 的细胞中添加 D - 丙氨酸，通过线粒体基质的 D - 氨基酸氧化酶（DAAO）生成过氧化氢，利用各亚细胞区域的 oROS-HT635 追踪扩散过程。

f. 迷你单线态氧发生器（miniSOG）在 488 nm 光刺激下生成超氧阴离子和过氧化氢，将其靶向表达于质膜外侧或线粒体基质；利用 CAAX-oROS-HT635 检测光遗传学诱导的过氧化氢向质膜内侧的扩散（3 次生物学重复）。

* 注：图中误差棒和误差带为基于 1000 次自助法的均值 95% 置信区间，采用 Seaborn v0.13.2 统计绘图包计算；d 图采用双侧独立 t 检验分析，P<0.05。

过氧化氢的空间可控扩散成像

我们将 oROS-HT635 的亚细胞定位突变体与区室特异性的化学生物学和光遗传学过氧化氢生成方法相结合，实现了过氧化氢时空分辨扩散的可视化。我们首先将 D - 氨基酸氧化酶（DAAO）靶向至线粒体基质（dMito-DAAO），该酶在补充 50mM D - 丙氨酸时可生成过氧化氢。利用定位于过氧化氢生成源头（线粒体基质）、膜间隙和质膜内侧（通过 CAAX 序列）的 oROS-HT635 亚细胞定位突变体，追踪不同区室中过氧化氢的扩散过程。

结果如预期所示，传感器捕捉到了过氧化氢从线粒体向质膜内侧扩散的时间过程（荧光变化率 5%-95% 的响应时间，单位：分钟 ± 标准差：线粒体基质 1.89±0.21、膜间隙 3.86±0.60、质膜内侧 7.81±0.39），揭示了过氧化氢在扩散路径中的缓冲效应，具体表现为从膜间隙向质膜内侧的扩散延迟时间远长于从线粒体基质向膜间隙的扩散。此外，dMito-DAAO 在线粒体中生成的过氧化氢可扩散至细胞外，我们在共培养体系中检测到了这种旁分泌扩散：表达细胞质 oROS-G 的 dMito-DAAO 阳性细胞在约 20.3 分钟时传感器激活 50%，而表达细胞质 oROS-HT635 的 dMito-DAAO 阴性细胞在约 36.5 分钟时传感器激活 50%。

此外，我们使用光敏蛋白 miniSOG 进行实验，该蛋白在 488nm 光激发下可产生活性氧和超氧阴离子，超氧阴离子可通过超氧化物歧化酶等生理机制进一步歧化生成过氧化氢。我们将 miniSOG 靶向至两个主要的内源性过氧化氢生成位点（线粒体基质，通过 dMito 序列；质膜外侧，通过 pDisplay 序列），利用定位于质膜内侧的 CAAX-oROS-HT635 检测过氧化氢向质膜内侧的扩散过程。线粒体基质和质膜外侧的 miniSOG 均可诱导质膜内侧的过氧化氢水平升高，且可被检测到，但线粒体基质的 miniSOG 诱导的响应更快、更显著（第一次 488nm 光脉冲刺激后，荧光变化率最小值 ± 标准差：质膜外侧为 - 2.46±0.55%，线粒体基质为 - 13.19±3.34%；第二次 488nm 光脉冲刺激后，荧光变化率最小值：质膜外侧为 - 7.38±2.14%，线粒体基质为 - 26.52±5.17%）。本研究中实现的过氧化氢双色成像与 oROS-HT635 的质膜特异性表达相结合，有助于研究过氧化氢生成源头与细胞内、外靶点间的相互作用，并达到亚细胞分辨率。

讨论

本研究开发了一种高亮度的过氧化氢远红化学生物学指示剂 oROS-HT635。为充分发挥 JF635 罗丹明染料的亮度优势，我们对该反向响应传感器进行优化，提升了其亮度和动态范围。由于 oROS-HT635 在传感器激活范围内（如部分氧化态）仍保持高亮度荧光，因此可在生理过氧化氢水平下检测到高保真的信号（图2g）。通过整合化学生物学报告系统（环排列型 HaloTag-JF635），该传感器实现了无氧依赖性、耐 pH、无光致变色伪影的成像，拓展了其应用范围（图3d，e）。

利用 oROS-HT635 的多重成像能力，我们将其与基于绿色荧光的氧化还原电位、钙离子和 pH 报告基因联用进行双色成像，可同时监测过氧化氢水平与氧化还原电位、钙离子或 pH 的变化（图3）。金诺芬是一种治疗类风湿关节炎的药物，因其具有剂量和细胞依赖性的多效作用模式，正受到肿瘤领域研究人员的关注，有望成为潜在的治疗候选药物。作为硫氧还蛋白还原酶 / 谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂，金诺芬可降低细胞内的抗氧化能力，从而升高氧化应激水平（图4b，c）。

有趣的是，近期旨在将金诺芬重新开发为潜在肿瘤治疗药物的研究发现，金诺芬的作用机制更为复杂—— 升高细胞氧化应激水平可激活核因子 E2 相关因子 2 等调控因子，进而增强细胞的抗氧化能力（图4d-i和图5）。本研究中，我们实时观察到低剂量金诺芬可诱导瞬时的氧化应激，随后过氧化氢水平以不依赖谷氧还蛋白的方式逆转，且该逆转过程的时间进程与人胚肾 293 细胞中核因子 E2 相关因子 2 向细胞核的转位增加相关，与此前的研究结果一致。

金诺芬诱导的抗氧化扰动还可改变人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子的瞬时动态变化，且这一变化与过氧化氢水平升高相关。我们通过对氧化应激影响两种关键钙离子转运体（L 型钙离子通道和肌浆网钙离子 ATP 酶）的过程进行计算模拟，重现了上述实验观察结果。我们的研究结果与此前的研究一致，证实氧化应激与多种细胞类型的钙离子转运过程密切相关（图6）。

需要说明的是，钙离子与氧化还原的相互作用具有复杂性，在完全分化的心肌细胞中，这种相互作用可能更为显著。本研究仅通过修改 L 型钙离子通道和肌浆网钙离子 ATP 酶的相关参数，重现了人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的实验响应，而在成熟心肌细胞中，心肌二联体结构、线粒体功能和钠钙交换体活性等因素可能会放大活性氧对钙离子动态变化的影响。这些复杂的相互作用需要进一步研究，以明确其如何随细胞发育而变化，从而更好地理解氧化应激在不同细胞类型和发育阶段钙离子转运过程中的作用。

研究人员还可利用 oROS-HT635 优异的亚细胞靶向能力，在更接近或远离过氧化氢生成源头的位置，以更高的空间分辨率监测过氧化氢的变化。基因编码过氧化氢指示剂通过以空间分辨的方式实现过氧化氢动态变化的光学监测，在揭示细胞内过氧化氢的空间分布特征方面发挥了关键作用，目前的研究主要集中在细胞质和线粒体区域。oROS-HT635 可帮助研究人员深入研究过氧化氢的生物学功能，揭示质膜区域的过氧化氢动态变化和旁分泌过氧化氢的作用，从而更细致、系统地理解生物体系中过氧化氢的动态变化规律。具体而言，定位于质膜的 oROS-HT635 为研究质膜附近过氧化氢的空间分布特征提供了可能。

oROS-HT635 基于 JF635 的设计使其具备多项关键优势，如远红荧光亮度高、无氧依赖性、pH 依赖性降低等。由于染料与传感器共价结合，一旦结合完成，其荧光信号便不再依赖于游离染料的浓度。但与现有的基于环排列型荧光蛋白的过氧化氢传感器相比，oROS-HT635 需要外源性添加染料是其潜在的劣势。本研究中 oROS-HT635 的检测依赖于强度型测量，因此信号本质上具有定性特征，尽管如此，该传感器仍能精准反映过氧化氢生成事件与后续生理现象间的时空关联。对于稳态测量，需要考虑不同传感器的表达水平差异，例如可引入对照荧光蛋白进行校准。

oROS-HT635 的下一代改造版本可针对发射光谱在 494nm-722nm 范围内的其他 JF 染料进行优化，进一步提升其在多重光遗传学应用中的灵活性。oROS-HT635 未来的另一开发方向是最大化其体内应用能力。JF635 染料虽具有优异的荧光特性，但其生物利用度较低，成为动物体内应用的一大挑战。我们设想了两种优化 oROS-HT635 活体动物应用的途径：其一，可通过注射套管或药物递送系统等工程化手段，将染料递送至脑组织；其二，可参考 Farrants 等人近期的研究，利用生物利用度高的染料（如 JF669）对 oROS-HT635 进行优化，以实现高效的动物体内应用。此外，对传感器的报告机制进行改造，使其量子产率更易发生变化，也可提升其在荧光寿命成像显微镜中的兼容性，从而实现过氧化氢的原位定量检测。

综上所述，oROS-HT635 可实现高时空分辨率的过氧化氢监测，与现有光遗传学工具联用时具有灵活的多重应用能力。oROS-HT635 具有快速的动力学特性和优异的亚细胞靶向能力，尤其可定位于质膜的内外侧，使其成为研究质膜附近过氧化氢空间分布特征的重要工具。将 oROS-HT635 与针对多种分析物的荧光传感器联用，可对过氧化氢的动态变化和生理响应进行动态、多参数分析，同时获得精准的空间信息，从而更全面地理解过氧化氢在细胞生理过程中的作用。

方法

伦理声明

本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求开展，所有动物操作均遵循华盛顿大学批准的机构动物护理和使用委员会方案（编号 4422-01 和 4383-02），并符合美国国立卫生研究院和国际实验动物评估和认可委员会的准则。华盛顿大学已向美国国立卫生研究院实验动物福利办公室提交了批准的动物福利保证书（编号 A3464），在美国农业部完成注册（证书编号 91-R-0001），并获得国际实验动物评估和认可委员会的认证。

统计学分析与可重复性

大多数实验至少进行三次独立的生物学重复（样本量 n≥3），以保证实验的稳健性和可重复性。所有分析的原始数据和描述性统计结果均可在 figshare 平台获取（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691），并尽可能使用自动化定量方法以减少人为偏差。使用 Python 软件（NumPy、SciPy 和 Seaborn 库）进行数据处理和统计分析，利用 Seaborn v0.13.2 进行统计可视化。图中的误差棒和误差带代表均值的 95% 自助法置信区间（重采样次数 n=1000），箱线图展示中位数、四分位距、须（延伸至 1.5 倍四分位距）和离群值。采用双侧独立样本 t 检验进行统计比较。本研究的完整最小原始数据集及下游分析和可视化代码均可在 figshare 平台公开获取（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691），以保证实验的可重复性。假设数据呈正态分布，但未进行正式的正态性检验。尽管数据收集和分析未采用盲法，但我们利用高通量计算流程，通过 FUSE v0.1.0-alpha 软件无偏提取荧光数据。

分子生物学实验

所有 oROS-HT 突变体均以 pC1-HyPer-Red 质粒（Addgene 编号 48249）的 pC1 质粒为骨架，插入 pAAV-synapsin-HaloCaMP1a-EGFP 质粒（Addgene 编号 138327）的片段构建而成。采用体外组装克隆技术设计构建 oROS-HT 筛选突变体所需的点突变或片段组装引物，并由集成 DNA 技术公司合成。使用 SuperFi-II 聚合酶（英杰公司，货号 12368010）进行所有基因片段的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证 DNA 片段的扩增效果。对每个 PCR 产物进行 30 分钟的 DpnI 酶切处理，以去除 PCR 样本中的质粒模板。利用体外组装克隆技术实现 PCR 产物的环化或组装，并将线性 DNA 产物转化至感受态大肠杆菌细胞（DH5α 或 TOP10），在含卡那霉素选择抗生素（50μg/mL）的琼脂平板上培养。

菌落形成后，挑取单菌落，在含 LB 肉汤（费舍尔生物试剂公司，货号 BP9723-2）和选择抗生素卡那霉素（50μg/mL）的 5mL 培养基中过夜培养（37℃、230rpm）。使用玛赫瑞根 DNA 提取试剂盒（玛赫瑞根公司，货号 740490.250）提取质粒 DNA，通过桑格测序（金唯智公司）或全质粒纳米孔测序（Plasmidsaurus 公司）验证目标突变是否存在。将编码最终突变体的基因克隆至 CAG 启动子驱动的 pCAG-Archon1-KGC-EGFP-ER2-WPRE 质粒（Addgene 编号 108423）中，方法同上，并通过桑格测序或全质粒纳米孔测序验证所有后续序列。此外，pC1-CMV-mito-DAAO 质粒（Addgene 编号 141132）和 pC1-SypHer3s-IMS 质粒（Addgene 编号 108120）由 Addgene 质粒库惠赠。基于 miniSOG-C1 质粒（Addgene 编号 54821），由 Twist Bioscience 公司合成 miniSOG1 基因片段，并将其替换 pC1-dmito-oROS-HT 和 pDisplay-oROS-HT 中的 oROS-HT 序列。

蛋白质结构预测与分析

使用 Chimera-X-1.7.1 软件进行蛋白质结构分析和绘图，从蛋白质数据库中导入氧化态（PDB 编号 1I6A）和还原态（PDB 编号 1I69）的大肠杆菌氧应激调节蛋白晶体结构。通过匹配算法对还原态和氧化态的大肠杆菌氧应激调节蛋白结构进行叠合，该算法通过构建两两序列比对并拟合比对的残基对，确定残基间的两两距离。利用 ColabFold 软件预测 213-214 位插入突变体的结构，参数设置为：多序列比对方法 = mmseqs2、同源寡聚体 = 1 或 2、配对多序列比对 = 否、最大多序列比对数 = 512:1024、多序列比对重采样 = 是、弛豫次数 = 无或 1、使用加速模式 = 是、使用预测的模板建模分数 = 是、按预测的局部距离差异测试分数排序 = 是、模型数 = 3 或 5、样本数 = 1、集成数 = 1、最大循环数 = 6/24/48、容差 = 0、训练模式 = 否、使用模板 = 否。将 JF635 的假定结合位置整合至 ColabFold 对 213-214 位插入突变体的结构预测中，通过匹配算法获得结合 JF635 的环排列型 HaloTag 结构（PDB 编号 6U2M）。

实验试剂

本研究中使用的 JF635 和 JF585 HaloTag 配体（JF-HTLs）由贾尼利亚研究园区材料项目组惠赠。将 JF-HTLs 溶解于 100% 二甲基亚砜中，配制成 200μM 的储存液，除非另有说明，实验中细胞均在 200nM JF-HTL 中孵育 1 小时后进行成像。尽管无需洗脱染料，但成像前仍将细胞更换为成像培养基。过氧化氢工作液均在每次实验前由 30%（质量体积比）过氧化氢水溶液（西格玛奥德里奇公司，货号 H1009）新鲜配制。将甲萘醌（西格玛奥德里奇公司，货号 M9429）溶解于 100% 二甲基亚砜中，配制成 50mM 的储存液；将金诺芬（Tocris Bioscience 公司，货号 46-005-0）溶解于 100% 二甲基亚砜中，配制成 50mM 的储存液。

蛋白质纯化

利用 pET29b 载体，在新英格兰生物实验室的 BL21 (DE3) 大肠杆菌菌株中表达 oROS-HT。将单菌落培养的 LB 过夜菌按 1:100 的比例，接种至含 50μg/mL 卡那霉素的 TBII 培养基（MpBio 公司）中，1500mL 表达培养基于 37℃培养 4 小时后，加入异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷诱导表达，继续在 18℃、225rpm 条件下培养 24 小时。通过 4000g 离心收集菌体，并重悬于含 50mM Tris（pH8.0）、300mM NaCl、20mM 咪唑、1mM 苯甲基磺酰氟、100μg/mL 溶菌酶（西格玛奥德里奇公司）和 10μg/mL 脱氧核糖核酸酶（西格玛奥德里奇公司）的缓冲液中。通过超声破碎菌体，18000g 离心 30 分钟，收集上清液，利用装填有镍离子螯合琼脂糖树脂（凯杰公司）的重力柱，通过固定化金属亲和层析纯化蛋白。用含 20mM 咪唑的缓冲液洗涤层析柱，用含 300mM 咪唑和 1.5mM 二硫苏糖醇的缓冲液洗脱蛋白。利用配备 Superdex 200 Increase 10/300 GL 层析柱（通用电气医疗生命科学公司）的 ÄKTA 快速蛋白液相色谱系统，通过体积排阻层析进一步纯化蛋白，层析柱用含 25mM Tris（pH8.0）、150mM NaCl 和 1.5mM 二硫苏糖醇的缓冲液平衡。

oROS-HT635 与 JF635-HTL 结合后的荧光光谱分析

使用氟麦克斯 - 4 荧光分光光度计（堀场公司）测定 oROS-HT635 的量子产率。测定前，将 1.5μM oROS-HT635 与 2μM JF635-HTL 在含 25mM Tris（pH8.0）、150mM NaCl 和 1.5mM 二硫苏糖醇的溶液中，室温孵育 1 小时。以 635nm 光激发，测定 oROS-HT635 的发射光谱，并与尼罗蓝染料的发射光谱对比，计算其荧光量子产率。

细胞内亮度对比实验

在表达各传感器 C 端融合增强型绿色荧光蛋白的人胚肾 293 细胞中，对比 oROS-HT635 和 HyPerRed 的细胞内亮度。使用配备 HC PL APO CS2 20 倍 / 数值孔径 0.75 干式物镜的徕卡 Stellaris Falcon 共聚焦显微镜进行成像，所有测量均使用一致的成像参数，包括单向扫描速度（400Hz）、像素驻留时间（1.41μs）和 HyD X 检测器的光子计数模式。为最大限度减少自发荧光伪影，对像素进行时间门控，仅收集荧光寿命在 1.04-8ns 范围内的信号。使用 Cellpose 软件进行图像分割，以便对每个细胞的平均光子计数进行下游分析。

为基于 10nm 光谱峰带通对比 HyPerRed（激发光 575nm，发射光 600-610nm）和 oROS-HT635（激发光 640nm，发射光 650-660nm）的亮度，将光子计数归一化至各自融合的增强型绿色荧光蛋白（激发光 488nm，发射光 508-518nm）的荧光信号。三种荧光团均由白光激光器（徕卡公司，设置为最大功率的 85%）以约 49μW 的激光功率激发。将提取的每个细胞的平均光子计数，进一步校正光谱效应（即短波对应更高能量的光子）和 HyD X 检测器已报道的光子检测效率。在相同的任意激光功率设置下，对 oROS-HT635（激发光 640nm，发射光 650-800nm，10nm 带通）和 HyPerRed（激发光 575nm，发射光 585-735nm，10nm 带通）进行波长扫描，并将扫描结果归一化至光功率计测量的实际激发光子通量，最后将波长扫描得到的光子计数归一化至各传感器融合的增强型绿色荧光蛋白的光子计数。

有序光滑内质网实验

以 CytERM-mTurquoise2（Addgene 编号 98833）和 CytERM-dTomato（Addgene 编号 98834）分别作为阴性和阳性对照，进行有序光滑内质网（OSER）实验，对比 oROS-HT635 和 HyPerRed 的单体化水平。将两种传感器均克隆至 CytERM 质粒中，通过脂质体转染法在人胚肾 293 细胞中表达，利用华盛顿大学干细胞与再生医学研究所成像核心平台的徕卡 SP8 共聚焦显微镜获取有序光滑内质网实验的成像图像，手动计数有无涡旋结构的细胞，计算有序光滑内质网比率。

哺乳动物细胞培养

人胚肾 293 细胞（美国典型培养物保藏中心，编号 CRL-1573）在含谷氨酰胺添加剂的 DMEM 培养基（吉布科公司，货号 10569-010）和 10% 胎牛血清（西澳生物公司，货号 S1620）中培养。当细胞融合度达到 85% 时，以每孔 150000 个或 75000 个细胞的密度，将细胞接种至 24 孔板或 48 孔板中。细胞接种 24 小时后，使用脂质体 3000 转染试剂（英杰公司，货号 L3000015）进行转染，24 孔板每孔转染 1000ng DNA，48 孔板每孔转染 500ng DNA，操作按试剂盒说明书进行。双转染实验中，将两种质粒按等质量比混合后进行转染。

原代大鼠皮质神经元的制备方法参照此前的研究报道，在含 B-27 添加剂（吉布科公司，货号 17504044）和谷氨酰胺（吉布科公司，货号 35050061）的神经元基础培养基（吉布科公司，货号 10888022）中培养，每 3 天换液一次，并通过弗雷德・哈钦森癌症研究中心载体生产核心平台制备的粗制 AAV9-CAG-oROS-HT 病毒进行转导。

脑组织切片成像

大鼠全脑半球器官型脑片制备

对出生后 10 天的雄性大鼠腹腔注射过量戊巴比妥（120-150mg/kg 体重），随后快速断头，取出全脑并切分为脑半球，置于含 0.64%（质量体积比）葡萄糖、100% 汉氏平衡盐溶液和 1% 青霉素 - 链霉素的冰浴解剖液中。参照此前的研究报道，使用组织切片机切取 300μm 厚的全脑半球活体切片，将切片转移至 6 孔板中铺有 0.4μm 孔径膜的 35mm 细胞培养小室中，在 1mL 含 5% 热灭活马血清的脑片培养基（含 50% 最低必需培养基、45% 汉氏平衡盐溶液、1% 谷氨酰胺添加剂和 1% 青霉素 - 链霉素）中培养，培养条件为 37℃、5% 二氧化碳，无菌恒温恒湿培养箱。

腺相关病毒转导与共聚焦成像

体外培养 1 天后，向脑片中加入粗制 AAV9-CAG-oROS-HT 病毒液，培养 3 天后，向脑片中加入 1μM JF635-HTL，继续孵育 48 小时。将器官型全脑半球脑片转移至 35mm 共聚焦培养皿（维尔特公司，货号 75856-742）中，使用尼康公司的 10 倍（尼康 Plan Apo 10 倍 / 数值孔径 0.45）和 20 倍（尼康 Plan Apo 20 倍 / 数值孔径 0.75）物镜进行共聚焦成像，在 Cy5 通道下获取脑片的拼接图像，随后从每个脑片的皮质和纹状体区域选取多个代表性区域成像，300μM 过氧化氢刺激前后的成像参数保持一致。

干细胞来源心肌细胞和神经元的分化

人诱导多能干细胞培养与心肌细胞分化（扩散实验）

未分化的 IMR90 人诱导多能干细胞（威斯康星州细胞库）在包被基质胶（康宁公司）的细胞培养板中，用 mTeSR1 培养基（干细胞技术公司）培养。参照此前的研究报道，采用改良的小分子 Wnt 信号调控方案，使用 Chiron 99021 和 IWP-4 诱导心肌细胞定向分化，分化后通过乳酸富集法纯化人诱导多能干细胞来源心肌细胞。

人诱导多能干细胞培养与心肌细胞分化（金诺芬实验）

未分化的人诱导多能干细胞（WTC11，雄性）在包被基质胶（康宁公司）的细胞培养板中，用 mTeSR1 培养基（干细胞技术公司）培养。参照此前的研究报道，采用基于 RPMI 培养基、牛血清白蛋白和抗坏血酸的改良方法诱导心肌细胞定向分化，诱导后第 8 天可观察到细胞自发收缩，第 12 天将培养基体积减至 1mL，为第 13 天 42℃热休克 45 分钟做准备。热休克后，将培养基更换为 1mL 新鲜的 RPMI+B-27 + 胰岛素培养基，第 14 天用 0.05% 胰蛋白酶（赛默飞世尔公司）消化细胞，用 BAMBANKER 细胞冻存液重悬后冻存于液氮中。

复苏时，将心肌细胞在含 90% RPMI+B-27 + 胰岛素和 10% 敲除血清的培养基中复苏，并加入 10μM ROCK 抑制剂，接种至包被基质胶的培养板中。复苏 24 小时后，将培养基更换为新鲜的 RPMI+B-27 + 胰岛素培养基，此后每两天换液一次。

人诱导多能干细胞培养与皮质神经元分化

从已鉴定的野生型 J. Craig Venter 背景人诱导多能干细胞系中制备皮质神经元培养物，参照此前的研究报道，通过双 SMAD 抑制法将人诱导多能干细胞分化为神经祖细胞，再将神经祖细胞分化为神经元。具体而言，神经祖细胞在基础神经维持培养基（1:1 的 DMEM/F12 培养基（赛默飞世尔科技公司，货号 11039047）+ 谷氨酰胺培养基 / 神经基础培养基（吉布科公司，货号 21103049）、0.5% N2 添加剂（赛默飞世尔科技公司，货号 17502-048）、1% B-27 添加剂（赛默飞世尔科技公司，货号 17504044）、0.5% 谷氨酰胺添加剂（赛默飞世尔科技公司，货号 35050061）、0.5% 胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒添加剂（赛默飞世尔科技公司，货号 41400045）、0.5% 非必需氨基酸（赛默飞世尔科技公司，货号 11140050）、0.2%β- 巯基乙醇（赛默飞世尔科技公司，货号 21985023）和 20ng/mL 成纤维细胞生长因子（R&D 系统公司））中扩增至 10cm 培养板中，待神经祖细胞融合度达 100% 后，更换为神经分化培养基（基础神经维持培养基 + 0.2mg/mL 脑源性神经营养因子（佩普泰克公司，货号 450-02）+0.2mg/mL 胶质细胞源性神经营养因子（佩普泰克公司，货号 450-10）+0.5M 双丁酰环腺苷酸（西格玛奥德里奇公司，货号 D0260）），每周换液两次，培养 21 天后分化完成。

为从皮质神经元培养物中分离神经元，采用磁珠分选法（碧迪生物科学公司，货号 557899）去除 CD44+、CD184 + 和 CD271 + 细胞（碧迪生物科学公司，货号分别为 550989、557145 和 557196），将纯化后的神经元以每孔 200000 个细胞的密度接种至 96 孔板中。

免疫荧光染色

使用多克隆抗核因子 E2 相关因子 2 抗体（英杰公司，货号 PA5-27882）和驴抗兔 IgG Alexa Fluor 488 二抗（英杰公司，货号 A21206）进行核因子 E2 相关因子 2 的免疫荧光染色。将各实验组的人胚肾 293 细胞用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，0.2% 曲拉通 X-100 溶液透化 1 小时，用含 0.5% 牛血清白蛋白的吐温 - 20 Tris 缓冲盐溶液封闭 1 小时后，将细胞与 1:200 稀释的一抗在封闭液中 4℃孵育过夜。次日，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，再将细胞与 1:1000 稀释的二抗在含 0.5% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中 4℃孵育过夜，用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片液（载体实验室公司）进行复染。

显微镜成像

除非另有说明，本研究的成像实验按以下方法进行：落射荧光成像实验在徕卡 DMI8 显微镜上进行（赛默洛克带通滤光片：绿色荧光蛋白比率成像激发 / 发射光：FF01-391-23/FF01-520-35，绿色荧光蛋白激发 / 发射光：FF01-474-27/FF01-520-35，红色荧光蛋白激发 / 发射光：FF01-554-23 或 FF01-578-21/FF01-600-37，远红荧光激发 / 发射光：FF01-635-18/FF01-680-42），由 MetaMorph 成像软件控制，配备科学级互补金属氧化物半导体相机（光度学公司 Prime95B）和 20 倍物镜（徕卡 HCX PL FLUOTAR L 20 倍 / 数值孔径 0.40）或 10 倍物镜（徕卡 HC PL FLUOTAR L 10 倍 / 数值孔径 0.32）。

共聚焦成像实验在华盛顿大学干细胞与再生医学研究所成像核心平台的徕卡 SP8 共聚焦显微镜上进行，细胞在含 10mM 葡萄糖的活细胞成像液（LCIS+，吉布科公司，货号 A14291DJ）中成像。

低氧条件下人胚肾 293 细胞中 oROS-HT635 传感器的成熟实验

人胚肾 293 细胞以每孔 150000 个细胞的密度接种至 24 孔板，两天后将培养基从完全 DMEM 培养基更换为含 20mM HEPES 的完全 Fluorobrite DMEM 培养基（吉布科公司，货号 A1896701），适应 2 小时后，用脂质体转染法将 pC1-oROS-HT-C199S（功能缺失型）质粒与 100nM JF635-HTL 共转染细胞。转染后立即将细胞分为两组，一组在 37℃常氧环境中孵育，另一组在 37℃低氧环境中孵育；低氧条件的构建方法为：将培养板转移至密封培养室中，以 10L/min 的流速通氮气 10 分钟后，将培养室置于培养箱中。约 18 小时后，按上述方法进行落射荧光成像。

多重成像实验

oROS-HT635/SypHer3s

将共转染 pC1-oROS-HT/pC1-SypHer3s 或 pC1-oROS-HT-C199S/pC1-SypHer3s 的人胚肾 293 细胞，在落射荧光显微镜下成像，pH 实验在不同 pH 的磷酸盐缓冲液（吉布科公司，货号 10010001）中进行，以 0.67Hz 或 0.5Hz 的频率捕捉绿色荧光蛋白和远红荧光的信号变化。

oROS-HT635/GRX1–roGFP2

将共转染 pC1-oROS-HT 和 pC1-GRX1-roGFP2 的人胚肾 293 细胞在含 10mM 葡萄糖的活细胞成像液（LCIS+，吉布科公司，货号 A14291DJ）中培养，在落射荧光显微镜下成像。为检测 oROS-HT/GRX1–roGFP2 对 10μM 过氧化氢的序贯响应，以 1Hz 的频率捕捉绿色荧光蛋白和远红荧光的信号变化；为检测其对金诺芬的响应，以 1 分钟 / 次的频率捕捉绿色荧光蛋白比率、绿色荧光蛋白和远红荧光的信号变化。

oROS-HT635/Fluo-4

将人诱导多能干细胞来源心肌细胞在含 5μM Fluo-4（英杰公司，货号 F14201）和 JF635-HTL 的 RPMI+B-27 + 胰岛素培养基中孵育 1 小时后成像，为检测其对金诺芬的响应，在含 HEPES 缓冲液的 RPMI+B-27 + 胰岛素培养基中，以 10 秒 / 次的频率捕捉绿色荧光蛋白（10Hz）和远红荧光（0.1Hz）的信号变化。

oROS-HT635/oROS-G

将共转染 pDisplay-oROS-HT 和细胞质 oROS-G 的人胚肾 293 细胞，以 1Hz 的频率成像，检测其对甲萘醌的响应，从有响应的细胞中提取荧光响应数据进行下游分析；将分别表达 oROS-HT 和 oROS-G 的人胚肾 293 细胞共培养，以 0.25Hz 的频率成像，实现旁分泌过氧化氢的可视化。

oROS-HT635/miniSOG

为利用 miniSOG 诱导光敏感的超氧阴离子生成，将同时表达 miniSOG（dMito 或 pDisplay 标签）和 CAAX-oROS-HT 的人胚肾 293 细胞，接受两次时长为 5 秒的光照（功率密度约 8.15mW/mm²），光照采用上述绿色荧光蛋白的激发光参数。

数据分析

使用 FUSE 软件（一款基于 Python 的定制云基半自动时间序列荧光数据分析平台）分析细胞荧光成像数据。首先，手动验证所选 Cellpose 模型的细胞分割质量，对于表达细胞质荧光指示剂的细胞，选择 “cyto” 模型作为基础模型；若所选 Cellpose 模型的分割效果较差，则利用 Cellpose 2.0 人机交互系统对模型进行进一步训练。利用优化后的分割模型，提取每个感兴趣区域的荧光时间序列数据，从而无偏提取所有实验样本的细胞荧光变化信息。使用定制的 Python 脚本，按文本说明对提取的荧光数据进行归一化处理。对于亚细胞定位的 oROS-HT635，提取传感器表达阳性的像素点数据，以最大限度减少因细胞形态差异导致的背景像素偏差。核因子 E2 相关因子 2 转位实验的具体方法和代码见补充图 8 和 figshare 平台（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691）。

细胞水平计算建模

我们使用现有的人诱导多能干细胞来源心肌细胞膜动力学模型，并进行一处修改：实验观察到人诱导多能干细胞来源心肌细胞的自发搏动频率约为 0.5Hz，为在计算模拟中反映该结果，我们将基线模型中内向整流钾电流（IK1）的最大值提高 1.71484375 倍，使自发搏动频率从 1.1Hz 降至 0.5Hz。该模型包含主要离子电流、离子通道和离子泵的表征（追踪的细胞内离子种类：钠离子、钾离子、钙离子），肌浆网被建模为一个独立的富钙细胞内区室，钙离子在肌浆网和细胞质间的转运通过三种离子流介导：Jup（肌浆网钙离子 ATP 酶 2a 介导的肌浆网钙离子重摄取）、Jrel（兰尼碱受体 2 介导的肌浆网钙离子释放）和 Jleak（钙离子从肌浆网向细胞质的被动渗漏）。

为模拟活性氧对人诱导多能干细胞来源心肌细胞的影响，我们修改肌浆网钙离子 ATP 酶 2a 的最大外排速率、肌浆网钙离子渗漏振幅和 L 型钙离子通道的最大电导等参数进行模拟实验：Jup 的缩放因子在 0.1-1.0 之间，步长为 0.1；Jleak 和 L 型钙离子通道的缩放因子在默认值（1.0）-2.0 之间，步长为 0.1。使用 openCARP 软件（一款免费的非商业性心脏电生理学建模软件，链接：http://opencarp.org/）进行生物电活动的模拟，所有模拟实验的模拟时间为 100 秒，我们通过系统性验证确认，该时间足以使每个模型扰动版本达到稳态（即膜电位或钙离子瞬时变化的形态无搏动间差异）。使用定制的 Python 脚本对模拟得到的细胞质钙离子时间序列数据进行后续分析，所有模拟实验使用的脚本和文件均可在 figshare 平台获取（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691）。

数据可用性

本研究实验的完整最小原始数据集、代表性图像、下游分析和可视化结果均可在 figshare 平台获取（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691）。本研究中描述的 oROS-HT 及其功能缺失型（C199S）和亚细胞定位突变体的质粒，均可通过 Addgene 质粒库获取，编号分别为：pC1-lifeact-oROS-HT（216420）、pC1-IMS-oROS-HT（216419）、pC1-dmito-oROS-HT（216418）、pC1-oROS-HT-CaaX（216417）、pDisplay-oROS-HT（216416）、AAV2_CAG_oROS-HT (C199S)_WPRE（216415）、AAV2_CAG_oROS-HT_WPRE（216414）、pC1_oROS-HT（216413）和 pC1_oROS-HT_LF (C199S)（216412），也可通过邮件索取。本研究的结构分析使用了蛋白质数据库中的编号 1I6A、1I69 和 6U2M 的结构数据，研究的源数据随论文一同提供。

代码可用性

模拟实验、数据提取、分析和可视化使用的源代码，均可在 figshare 平台获取（链接：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28306691）。

作者贡献

Justin Daho Lee 和 Andre Berndt 构思了研究设计和 oROS-HT635 的工程化改造策略，完成实验并分析数据；Justin Daho Lee、Amanda Nguyen、Shani Zuniga 和 Annette Smith 克隆并筛选传感器突变体；Justin Daho Lee、Yuxuan Wang、Aida Moghadasi 和 Vedant Chavan 构建亚细胞过氧化氢的化学生物学 / 光遗传学验证载体，并进行数据分析；Justin Daho Lee、Sarah J. Wait 和 Hojun Choi 完成纯化蛋白实验并分析数据；Justin Daho Lee、Chelsea E. Gibbs 和 Patrick M. Boyle 完成人诱导多能干细胞来源心肌细胞的计算机模拟和分析；Justin Daho Lee 和 Zheyu Ruby Jin 完成低氧条件下的传感器成熟实验、脑组织切片成像和分析；Kira M. Evitts、Anthony Asencio、Samantha B. Bremner、Inez K. A. Pranoto 和 C. Andrew Williams 完成人诱导多能干细胞来源细胞的分化和制备；Andre Berndt、Patrick M. Boyle、Elizabeth Nance、David L. Mack、Jessica E. Young、David Baker、Michael Regnier 和 Farid Moussavi-Harami 指导实验材料的制备、实验开展、数据分析和论文撰写。

利益冲突

作者声明无利益冲突。