青春期社交隔离

青春期社交隔离会诱发母性照料的潜在脆弱性并产生代际社交后果，经验丰富的母鼠可逆转这一效应

Jose Francis-Oliveira, Rinako Tanaka, Matthew Shen, Emily Cruvinel, Shin-ichi Kano, Minae Niwa

摘要

生命早期逆境（Early-life adversity，ELA）可对大脑与行为产生持续性改变，但其对母性照料行为及代际社交结局的影响仍未被充分阐明。本研究采用轻度青春期社交隔离小鼠模型，证实青春期晚期经历隔离的雌性小鼠，在产后会逐渐出现针对幼崽的母性行为缺陷，包括哺乳、舔舐、筑巢及幼崽叼回行为，而自我导向行为则保持完好。由这类母鼠抚育的后代，在成年后出现社交行为缺陷，表现为社交能力降低、社交新奇性识别受损、社交气味辨别能力下降，但非社交记忆、焦虑样行为及自主运动能力均未受影响。通过化学遗传学激活应激母鼠后代的内侧扣带回皮层（medial cingulate cortex，mCg）→边缘前皮层（prelimbic cortex，PrL）通路，可逆转其社交缺陷；而在对照小鼠中抑制该通路，则会重现上述行为损伤。值得注意的是，在产后早期将应激母鼠与经验丰富的经产雌鼠共同饲养，可恢复其针对幼崽的母性行为，并使后代的社交结局恢复正常，表明社交经历能够缓冲生命早期逆境的代际影响。神经环路分析证实，mCg→PrL 投射是调控社交行为的关键兴奋性通路；电生理记录显示，应激母鼠后代的该环路功能低下，而产后与经产雌鼠共同饲养可改善这一异常。综上，本研究揭示了一条连接青春期社会心理逆境、母性照料受损与代际社交功能障碍的神经环路，并证实经验丰富母鼠提供的社交支持，是调控母鼠及后代行为结局的有效干预手段。

意义声明

孕前不良社交经历会损害母性照料能力，并将社交脆弱性跨代传递，但其内在机制仍不明确。本研究采用轻度青春期社交隔离小鼠模型，证实即便是轻微的隔离，也会选择性损伤产后照料行为，而不影响其他行为领域，最终导致后代成年后出现社交缺陷。本研究鉴定出内侧扣带回 - 边缘前皮层环路是介导上述效应的关键神经底物，并证实产后早期来自经验丰富母鼠的社交支持，可同时恢复母性行为与后代社交结局。本研究为青春期社会心理逆境的代际效应提供了神经与社交层面的机制解释。

引言

母性行为是支撑跨物种后代生存与长期健康的基础社交行为（1, 2）。在哺乳动物中，早期母婴依恋关系同时塑造母亲的心理健康与后代的社会情绪发育（3）。应激、精神疾病或社交支持不足引发的母性照料紊乱，会损害后代发育（4-7）。生命早期逆境（ELA）包括虐待、家庭功能失调、创伤与社交剥夺等，会长期增加精神与躯体疾病的发病风险，还与产后情绪障碍及母性照料受损相关（8-13）。然而，ELA 影响产后母性行为的神经机制仍未被充分阐明，部分原因在于多数动物模型依赖孕期激素干预（14-18），无法反映 ELA 对神经环路功能的持续性神经发育影响。

青春期是大脑与社交发育的关键敏感期，伴随激素水平变化与调控情绪及社交行为的神经环路精细化重塑（19）。啮齿类社交隔离是研究社会心理性 ELA 的常用模型（20-22），但多数范式采用长期或重度隔离，会立即引发行为与内分泌异常（23, 24）。与之不同，本团队构建了轻度青春期社交隔离模型，该模型不会引发可检测的即时行为改变，却会形成潜在脆弱性，并在产后阶段以母性情绪与社交相关行为损伤的形式显现（25, 26）。该模型可用于探究亚临床青春期逆境如何编程母性行为并影响下一代。与该框架一致，轻度青春期隔离会导致母鼠产后下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴长期调控紊乱、皮质酮水平持续升高，这与经历早期逆境的产后抑郁女性的表现相似（26）。综上，本研究明确了一条发育轨迹：青春期社会心理逆境会引发潜在的、情境依赖性的产后功能异常，应激轴改变是下游关联事件，而非充分的解释机制。

孕期会诱导母脑发生持续性适应，包括前扣带回皮层（anterior cingulate cortex，ACC）的结构重塑（27）。在人类中，背侧前扣带回皮层（dACC，与啮齿类边缘前皮层prelimbic cortex， PrL 同源）在健康母亲对婴儿线索做出反应时被激活，而照料困难母亲的该脑区激活程度降低（28, 29）。内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC，包含 PrL）在社交认知、情绪反应与母性行为表达中发挥核心作用（30-33）。在啮齿类扣带回皮层中，前扣带回皮层（anteriorcingulate cortex，aCg；前后位 AP +0.0 mm）与内侧扣带回皮层（mid-cingulate cortex，mCg；AP +1.0 mm）在结构与功能上相互独立，其中 mCg 参与注意力、冲突监测与社交认知（34-38）。尽管啮齿类 mCg 在母性行为与社交行为中的作用尚未被充分探究，但其参与 ELA 后持续紊乱的行为领域，提示该脑区可能是逆境相关功能损伤的易感神经位点。基于上述发现，本研究提出假说：皮层 - 皮层通讯紊乱（尤其是 mCg→PrL 通路）会导致母性照料受损与社交缺陷的代际传递。

母性环路在成年期仍具有可塑性，使得社交经历能够塑造照料行为。母鼠可通过观察经验丰富的照料者学习母性技能（39-44），凸显社交学习在育儿中的作用。对于有 ELA 史的母亲而言，社交支持尤为重要，这类母亲发生产后情绪障碍的风险更高，而情绪障碍会损害照料行为（45, 46）。然而，经验丰富照料者提供的社交支持缓解上述缺陷的机制，仍未被充分阐明。

本研究证实，轻度青春期社交隔离会在雌性小鼠中形成潜在脆弱性，该脆弱性在产后以母性照料受损的形式显现，其介导机制为 mCg→PrL 环路功能降低。该通路的功能异常会驱动后代出现社交缺陷，为 ELA 效应的代际传递建立了神经底物。重要的是，产后与经产雌鼠（本研究定义为至少经历过一次妊娠与分娩的雌鼠）共同饲养，可缓解母鼠的行为缺陷并逆转后代的社交结局，揭示了社交支持缓冲早期逆境长期后果的机制。

结果

青春期社交隔离损伤产后母性照料行为

本研究首先探究青春期晚期经历社交隔离的雌性小鼠，在分娩后是否出现母性行为改变。在出生后第 7 天（P7），应激母鼠的哺乳时长（图 1A）与舔舐幼崽时长（图 1B）显著低于无应激对照母鼠，整体母性照料行为（哺乳 + 舔舐总时长）显著降低（图 1C）。与之相对，攀爬、挖掘时长（图 1D）与自我梳理时长（图 1E）在两组间无差异；相应地，整体自我照料行为（攀爬 / 挖掘 + 自我梳理总时长）未受青春期隔离影响（图 1F）。上述结果表明，青春期社交隔离选择性损伤母鼠对后代的照料行为，而不广泛影响自我导向的维持行为。与此一致，应激母鼠搭建的巢穴更小、结构更紊乱（图 1G）。此外，应激母鼠叼回离巢幼崽所需的时间显著延长（图 1H），进一步证实产后 1 周母鼠的母性应答能力受损。

为明确上述母性缺陷是否在分娩后立即出现，本研究在 P1 时间点评估母性行为。在这一早期阶段，应激母鼠仅出现轻度或部分损伤，局限于舔舐与幼崽叼回行为（补充图 1A-H）。该结果提示，母性照料缺陷在产后第一周逐渐发展，可能反映母鼠对照料状态的适应延迟。

由于母性照料紊乱会影响后代健康，本研究评估了幼崽的整体健康状况。尽管母性照料减少，但应激母鼠抚育的后代（应激后代）体重增长与无应激母鼠抚育的后代（无应激后代）相当（补充图 2A）。但应激母鼠的幼崽死亡率更高，尤其在产后早期（补充图 2B）。应激母鼠每窝存活幼崽数量倾向于低于对照组，至 P8 时，应激后代的死亡数量更多，但上述差异未达统计学显著性（补充图 2C）。上述结果表明，青春期社交隔离会导致母鼠在产后第一周逐渐出现照料缺陷，即便存活幼崽的生长看似正常，该缺陷仍会导致幼崽早期死亡率升高。

青春期隔离诱导的母性缺陷导致后代成年后社交行为受损

本研究进一步探究青春期社交隔离诱导的产后母性照料缺陷，是否会影响后代成年后（>P56）的行为结局。在社交互动实验（SIT）中，应激后代的社交能力与社交新奇性识别能力均低于无应激对照（图 2A、B）。在社交嗅觉识别实验（SORT）中，应激后代对来自自身笼舍的熟悉社交线索与陌生鼠笼舍的新奇社交线索的探究行为均显著减少（图 2C），表明其社交线索识别能力广泛受损。与之相对，应激后代在新奇物体识别实验（NORT）、旷场实验（OFT）、高架十字迷宫实验（EPM）与明暗箱实验（LDB）中的表现与无应激后代无差异（图 2D-G）。两组后代在 OFT 中的自主运动能力与 NORT 训练阶段的辨别指数也相当（补充图 3A、B）。与应激敏感性升高一致，应激后代成年后的血清皮质酮水平显著高于无应激对照（补充图 4）。

上述结果提示，青春期隔离诱导的母性照料缺陷选择性损伤后代成年后的社交行为，而不影响整体自主运动、焦虑相关行为或非社交记忆。皮质酮水平的持续升高表明 HPA 轴功能长期紊乱，可能参与介导观察到的社交缺陷。综上，本研究支持以下结论：产后早期母性照料紊乱会导致后代社交行为与应激生理发生长期、领域特异性的改变。

mCg→PrL 通路调控社交行为并介导不良母性照料的效应

PrL 在调控社交行为中的作用已被证实（28），且本研究提出皮层 - 皮层连接是社交行为的核心环路底物，因此本研究进一步探究 mCg→PrL 通路是否在后代社交行为中发挥关键作用。

本研究采用设计药物专一激活的设计受体（Designer Receptors Exclusively Activated by DesignerDrugs，DREADDs）技术，表达仅被合成配体氯氮平 - N - 氧化物（clozapine-

N-oxide，CNO）激活的工程化 G 蛋白偶联受体 [M3 毒蕈碱（muscarinic）受体（hM3Dq；兴奋性）与 hM4Di（抑制性）]（47），以操控该通路。

在应激后代中激活 mCg→PrL 通路，可恢复其在 SIT 中的社交能力与社交新奇性识别能力（图 3A-C）。相反，在无应激后代中抑制该通路，则会诱导出与应激后代相似的行为缺陷（图 3D-F）。上述结果表明，mCg→PrL 通路功能低下参与介导应激后代的社交行为缺陷，且该通路是正常社交行为所必需的功能通路。

与经产雌鼠共同饲养可逆转针对幼崽的母性行为缺陷与后代社交缺陷

经产鼠的母性照料水平显著高于未生育雌鼠，即便在抚育寄养幼崽时也是如此（补充图 5A-G）。具体而言，经产雌鼠的哺乳时长（补充图 5A）与舔舐幼崽时长（补充图 5B）更长，整体照料行为（哺乳 + 舔舐总时长）更高（补充图 5C）。与之相对，自我导向行为（包括攀爬 / 挖掘与自我梳理）在两组间无差异（补充图 5D、E）；相应地，整体自我照料行为相当（补充图 5F）。经产雌鼠的幼崽叼回行为显著优于未生育雌鼠（补充图 5G）。综上，妊娠与分娩选择性增强针对后代的母性行为，而不广泛影响自我导向的维持行为。

基于上述发现，本研究进一步探究接触经验丰富母鼠是否可逆转母性缺陷。从 P0 至 P7（母性行为测试完成次日），将应激母鼠与经产雌鼠共同饲养。共同饲养期间，幼崽始终与应激母鼠共处，且可被两类母鼠接触，以便应激母鼠观察与潜在的社交学习。在母性行为测试前，暂时移走经产雌鼠，确保测得的行为反映应激母鼠对自身幼崽的应答，而非与经产雌鼠的直接互动。实验设计如图 4A 所示。P0 至 P7 的共同饲养可改善应激母鼠的筑巢行为，并逆转其针对幼崽的照料与叼回行为缺陷，而自我导向行为未受影响（图 4B-I）。与之相对，共同饲养对无应激母鼠的母性行为无影响（图 4B-I）。

重要的是，母性行为的逆转可转化为后代行为结局的改善。产后由母鼠与经产雌鼠共同抚育的应激后代，在 SIT 中的社交能力与社交新奇性识别能力得以恢复（图 5A、B）。上述结果表明，产后早期来自经验丰富母鼠的社交支持，选择性缓解针对幼崽的母性缺陷，并改善代际社交行为损伤。

应激后代的 mCg→PrL 兴奋性放电减少，与经产雌鼠共同饲养可恢复该功能

基于小鼠 mCg 与 PrL 存在皮层 - 皮层连接的证据，本研究采用逆行病毒示踪技术鉴定 PrL 的上游皮层输入。与本团队此前鉴定的 mCg→PrL 投射一致（36），本研究聚焦于该通路的进一步表征。向 PrL 注射逆行病毒后，多数标记的 mCg 神经元共表达钙 / 钙调素依赖性蛋白激酶 II（CaMKII，兴奋性神经元标志物），仅少量神经元共表达γ- 氨基丁酸（GABA，抑制性标志物）（图 6A-C）。此外，向 PrL 注射 CaMKII 启动子驱动的逆行病毒可标记大量 mCg 神经元（图 6D），证实 mCg→PrL 通路以兴奋性投射为主。

本研究进一步评估成年后代 mCg→PrL 神经元的电生理特性。由于 mCg 向 PrL 的皮层 - 皮层投射神经元主要位于 V 层（48, 49），本研究聚焦于该层神经元的记录。全细胞膜片钳记录显示，应激后代的神经元放电频率显著低于无应激对照（图 6E），表明 mCg→PrL 通路功能低下。与之相对，最小放电电流（rheobase）与静息膜电位无差异（补充图 6A、B），提示神经元固有膜兴奋性未改变。自发兴奋性与抑制性突触后电流的分析显示，两组的振幅与频率无显著差异（补充图 6C-F），表明 mCg→PrL 神经元的突触前输入保持完好。综上，数据提示不良母性照料会降低 mCg→PrL 神经元的输出活性，而不影响其固有兴奋性或上游突触输入。值得注意的是，与经产雌鼠共同饲养可恢复这些神经元的放电活性（图 6E），这与后代成年后社交行为的恢复相对应（图 5）。

讨论

青春期社交隔离会在雌性小鼠中建立潜在脆弱性，选择性损伤产后针对幼崽的行为（包括舔舐、哺乳、筑巢与幼崽叼回）。这些特异性母性缺陷会传递至下一代，导致后代成年后出现持续性社交缺陷，而其他行为领域不受影响。本研究揭示，mCg→PrL 投射是介导上述代际效应的关键兴奋性通路。关键的是，产后早期与经验丰富的经产母鼠进行社交接触，可选择性恢复母性照料并逆转后代的社交行为。该结果建立了母鼠经历、环路功能与后代发育之间的因果关联。本研究强调了青春期社会心理经历与产后社交环境，在塑造母性行为与后代社交轨迹中的双重重要性。

前额叶皮层是母性行为与社交行为的核心底物。本研究数据显示，青春期社交隔离会降低前额叶皮层兴奋性皮层 - 皮层通路（mCg→PrL）的放电输出，而突触前输入基本完好。这与此前报道一致：ELA 会选择性重塑兴奋性皮层 - 皮层环路，行为特异性反映了特定投射的易感性（25, 32, 50, 51）。潜在机制包括离子通道表达改变与电导调控信号通路的调制，这与社交等级环路中 TRPM3 依赖的调控机制相似（50）。功能操控实验证实，恢复该通路的活性足以逆转社交缺陷，而抑制该通路可模拟逆境诱导的损伤，凸显兴奋性皮层 - 皮层动态在整合母性线索与指导后代社交结局中的因果作用。

后代行为改变的特异性，凸显了早期母性照料对社交发育的关键影响（52, 53）。暴露于非最优母性照料的后代，皮质酮水平升高，而自主运动、焦虑反应与非社交记忆保持正常，提示应激轴持续调控紊乱（6, 54）。该模式与此前研究一致：触觉与哺乳刺激缺陷会导致 HPA 轴负反馈调控受损与应激反应异常（26, 55, 56）。尽管催产素信号可能也参与社交脆弱性的调控，但其受母性照料调控的具体机制仍未被探究（57-60）。本研究结果提示，母性缺陷会塑造社交环路的发育，而不广泛损害其他行为领域，为理解 ELA 如何跨代赋予社交功能障碍的特异性易感性提供了框架。

与经验丰富的经产母鼠共同抚育，可选择性改善应激雌鼠的母性行为，证实母性环路的可塑性（61, 62）。从机制上，该效应可能通过三条互补通路实现：（1）社交支持：亲和性陪伴降低心理应激并增强照料动机（63）；（2）行为模仿：应激母鼠通过观察经产同伴学习母性行为，即便模仿对象不在场，改善效果也可持续（40）；（3）应激缓冲：通过正常化皮质酮水平与恢复 mCg→PrL 神经元活性，增强照料能力（64, 65）。上述结果与此前研究一致：母性行为可在小鼠与其他哺乳动物中通过社交传递（39, 40, 66），凸显支持性社交环境缓冲逆境的转化潜力。

综上，本研究阐明了连接青春期社会心理逆境、产后母性功能异常与特异性代际社交缺陷的机制框架。本研究鉴定出 mCg→PrL 通路是社交行为经验依赖性调控的关键底物，为缓解 ELA 持续性效应的干预手段提供了理论基础。未来研究应阐明环路功能低下的分子与突触机制，探究跨代表观遗传修饰的潜在作用，并评估结构化社交支持干预在不同哺乳动物模型中的有效性。阐明这些过程可为人类社交功能障碍的发病机制提供见解，并助力开发促进 ELA 耐受的干预策略。

图表注释汇总

图 1

青春期社交隔离在产后 1 周损伤母鼠针对幼崽的母性行为，而不影响自我导向行为。（A-B）应激母鼠的哺乳（A）与幼崽舔舐（B）行为减少。（C）应激母鼠的幼崽导向总照料行为（哺乳 + 舔舐）显著降低。（D-E）自我导向行为（攀爬 / 挖掘（D）与自我梳理（E））无变化。（F）整体自我照料行为（攀爬 / 挖掘 + 自我梳理）组间无差异。（G）应激母鼠搭建的巢穴质量更差，巢穴评分更低。（H）应激母鼠的幼崽叼回潜伏期显著延长，表明母性应答能力降低。数据以均值 ±SEM 表示，每组 N=11-12。*p<0.05。统计检验：Student t 检验（A、C）、Welch t 检验（B）、Mann-Whitney U 检验（D-H）（视情况选用）。详细统计分析见补充表1。

图 2

应激母鼠抚育的后代出现选择性社交行为缺陷。（A）三箱社交互动实验（SIT）中，应激后代的社交能力低于无应激后代。（B）应激后代在 SIT 中的社交新奇性识别能力受损。（C）社交嗅觉识别实验（SORT）中，应激后代对熟悉与新奇社交气味的探究行为均减少。（D）母性逆境不影响新奇物体识别实验（NORT）表现。（E）旷场实验（OFT）中，中央区域停留时长组间无差异。（F-G）高架十字迷宫（EPM）与明暗箱（LDB）中的焦虑相关行为组间无显著差异。综上，应激母鼠的母性行为受损，选择性扰乱后代社交行为，而不影响认知与焦虑相关领域。数据以均值 ±SEM 表示，每组 N=18-32。*p<0.05。统计检验：Welch t 检验（A、B）、双因素混合 ANOVA（C）、Mann-Whitney U 检验（D、G）、Student t 检验（E、F）（视情况选用）。详细统计分析见补充表 1。

图 3

化学遗传学调控 mCg→PrL 通路可逆转或诱导社交缺陷。（A）向 mCg 注射 AAV-hSyn-hM3D (Gq)-mCherry 病毒、向 PrL 植入引导套管的示意图。（B-C）CNO 激活应激后代中表达 M3Dq 的 mCg→PrL 神经元，可逆转社交能力与社交新奇性识别缺陷。（D）向 mCg 注射 AAV-hSyn-hM4D (Gi)-mCherry 病毒、向 PrL 植入引导套管的示意图。（E-F）在无应激后代中采用 M4Di 受体抑制同一环路，可诱导社交缺陷。数据以均值 ±SEM 表示，每组 N=6。*p<0.05。统计检验：双因素 ANOVA（B-C）、Student t 检验（E-F）。详细统计分析见补充表1。

图 4

与经产雌鼠共同饲养可逆转应激母鼠的母性照料缺陷。（A）与经产雌鼠共同饲养的实验设计。（B-D）与经产雌鼠（而非未生育雌鼠）共同饲养的应激母鼠，幼崽导向行为增加。（E-G）自我照料行为不受共同饲养条件影响。（H-I）与经产雌鼠共同饲养后，巢穴质量与幼崽叼回能力改善。数据以均值 ±SEM 表示，每组 N=12。*p<0.05。统计检验：所有非正态数据采用 Mann-Whitney U 检验进行两两计划比较。详细统计分析见补充表 1。

图 5

与经产鼠共同饲养可逆转应激后代的社交缺陷。（A）应激后代的社交能力指数降低，出生至断奶期间与经产雌鼠共同饲养可逆转该缺陷。（B）社交新奇性识别呈现相似模式，经产鼠共同饲养可逆转该缺陷。数据以均值 ±SEM 表示。社交能力指数样本量 N=7-18。*p<0.05。统计检验：Kruskal-Wallis 检验（A）、Welch 单因素 ANOVA（B）。详细统计分析见补充表1。

图 6

mCg→PrL 通路以兴奋性为主，应激后代的放电频率降低，与经产鼠共同饲养可恢复。（A）左：向 PrL 注射 rgAAV-hSyn-EGFP 病毒的示意图。右：从 PrL 逆行标记的 EGFP 标记 mCg 神经元与 CaMKII 或 GABA 共定位的定量分析。数据以均值 ±SEM 表示，每组 N=3。每个点代表每只动物 3 张切片的平均值。（B-C）从 PrL 逆行标记的 EGFP 标记 mCg 神经元与 CaMKII 或 GABA 共定位的代表性免疫组化图像。比例尺：50 μm。（D）向 PrL 注射 CaMKII 启动子驱动的逆行病毒后，mCherry 标记神经元的示意图与代表性 mCg 图像，证实 mCg→PrL 环路的兴奋性特性。比例尺：100 μm。（E）应激后代 V 层 mCg→PrL 神经元的动作电位放电频率降低，与经产鼠共同饲养的应激后代可恢复该频率。放电频率样本量为每组 10-13 个细胞，取自每组 4 只不同小鼠。*p<0.05。统计检验：双因素混合 ANOVA（C）。详细统计分析见补充表1。