哺乳动物什么可能再生

【有些动物，如蝾螈，部分组织器官有很强的再生能力，哺乳动物再生能力非常弱。但指头的末端有再生能力。能否通过研究这一特殊现象，帮助我们理解再生？甚至帮助我们可以让哺乳动物的其他组织器官再生？是少数科学家的梦想】

透明质酸与组织力学协同调控哺乳动物指端再生

Byron WH Mui等

摘要

多数低等脊椎动物具备再生复杂组织的能力，而大多数哺乳动物则将这种能力替换为快速的伤口愈合与纤维化瘢痕形成。成年人类的这一“再生窗口” 几乎完全关闭，指端远端是少数能够完成多组织完全再生、恢复原有结构的组织之一；而更近端的截肢则会形成瘢痕。过往针对该现象的研究多聚焦于分子信号通路与细胞起源，然而在整体组织再生的背景下，外源信号 —— 尤其是来自周围微环境的物理与力学信号 —— 的作用仍知之甚少。

研究依据

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）绝非仅作为被动的结构支架，它还是调控组织功能的机械化学信号的动态储存库与信号枢纽。现有研究已明确基质刚度会影响细胞命运决定，如发育过程中的细胞迁移与增殖，但其作为再生与纤维化之间 “开关” 的作用尚未被阐明。我们提出假说：ECM 的特定组成与力学特性（如粘弹性）决定了损伤部位是启动再生程序还是瘢痕形成程序。本研究以小鼠指端为模型，同时对比成功再生与纤维化修复失败两种情况，旨在明确介导这两种不同结局的关键 ECM 组分。

研究结果

在小鼠指端截肢模型中，我们发现损伤后纤维化与再生的决定性因素是胶原蛋白基质与透明质酸（（hyaluronic acid，HA）的平衡。具体而言，瘢痕形成区域以坚硬、富含胶原蛋白的基质为主；与之相反，再生区域则以富含 HA 的基质为主，该基质构建了更柔软、更具粘性（粘弹性）的组织微环境。我们发现，HA 的存在可主动抑制胶原蛋白组装，阻止坚硬的纤维化组织形成。这种基质力学特性直接影响细胞对骨再生关键信号通路的响应能力：处于柔软、模拟再生微环境中的细胞可强烈激活下游效应分子，而处于 “坚硬” 环境中的细胞则响应减弱。尤为重要的是，我们证实仅调控单一 ECM 组分 —— 透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白 1（HAPLN1）以稳定 HA 网络，就足以在本会形成永久性瘢痕的损伤中触发骨再生。

研究结论

本研究结果证实，ECM 组成与力学特性是调控哺乳动物再生的核心机制。本研究通过证明 ECM 可作为机械化学信号枢纽，表明将物理微环境从坚硬的胶原蛋白态 “重调” 为柔软、富含 HA 的状态，能够解锁再生潜能。这一研究视角的转变 —— 从靶向细胞转向工程化改造基质 —— 为再生医学与纤维化疾病治疗提供了极具前景的新策略。本研究阐明了 ECM 在组织功能中的作用，为以 ECM 为靶点、促进哺乳动物组织再生的研究方向提供了支持。

图注：细胞外基质（ECM）与组织力学特性共同决定了手指截断后的伤口愈合结果。小鼠手指截断模型通过不同截断位置，为多组织纤维化与再生提供了并行对照研究条件。在近端截断中，胶原性ECM的积累及僵硬的组织力学特性会驱动瘢痕形成；而远端截断则通过富含透明质酸（HA）、柔软且具有流动性的ECM作用实现再生。针对瘢痕相关ECM及其力学特性进行干预，能够实现手指的功能恢复。[图表由BioRender.com制作]

正文

组织再生在哺乳动物中极为罕见，但指端在截肢后能够再生，而指甲以外部位的损伤则无法实现再生。微环境如何介导这两种截然不同的修复结局仍不明确。本研究发现，细胞外基质（ECM）与组织力学特性调控了小鼠指端截肢后的损伤响应：非再生区域质地更坚硬，且含有致密、有序排列的胶原蛋白；再生区域质地柔软，且富含透明质酸（HA）。清除 HA 会抑制再生并促进纤维化，这表明 HA - 胶原蛋白的平衡决定了组织力学特性与修复信号传导。在非再生性截肢后，利用透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白 1（HAPLN1）稳定 HA 可重调 ECM 力学特性、减少瘢痕形成并增强骨修复。综上，ECM 组成与力学特性可影响细胞行为，靶向 ECM 的策略有望解锁哺乳动物的组织再生能力。

正常伤口愈合依赖细胞外基质（ECM）合成以形成临时支架，而 ECM 过度累积（即纤维化）会破坏组织结构，并造成严重的疾病负担 (1)。研发能够阻断或逆转纤维化、促进再生的有效疗法，依赖于我们对伤口愈合机制的深入理解 (2)。为此，小鼠指端截肢模型为同时研究哺乳动物的再生与纤维化提供了理想平台 (3)。啮齿类与人类的第三指节远端（P3）截肢后，可实现多组织的完全修复 (3)，该过程的核心是再生芽基（blastema）(4)—— 一种由异质性祖细胞构成的暂时性结构 (5,6)，可重建缺失的组织 (7)。而更近端的截肢（如切断第二指节 P2）则无法实现再生 (3)，仅出现少量组织再生，瘢痕组织会覆盖受损的骨残端 (3)。本研究以成年小鼠指端截肢为模型，探究 ECM 如何介导再生而非纤维化的修复过程。

ECM 在组织形态发生 (8)、稳态维持 (9) 与衰老 (10) 等多种生物学过程中，提供关键的化学与力学信号。ECM 可影响再生 (11) 与纤维化 (12) 进程。无瘢痕的胎儿皮肤损伤研究表明，ECM 组分透明质酸（HA，一种由 N - 乙酰葡糖胺与葡糖醛酸构成的线性非硫酸化聚合物）具有保护作用 (13)。事实上，胎儿伤口愈合时胶原蛋白沉积极少，且 HA 水平持续维持在高位；而成年伤口则伴随大量胶原蛋白沉积与 HA 的快速降解 (14-16)。蝾螈前肢截肢后，再生芽基形成过程中出现的富含 HA 的基质可调控肌管迁移与去分化过程 (17)；而在爪蟾中，阻断 HA 信号会损伤尾部再生 (18)。HA 与 ECM 力学特性如何共同调控成年哺乳动物的再生与纤维化结局，目前仍知之甚少。

纤维化伤口修复过程中，ECM 通常会发生硬化 (19)，进而机械性激活 ECM 的主要调控细胞 —— 成纤维细胞 (20)。成纤维细胞会进一步通过改变 ECM 组成 (22) 或结构 (23) 重塑胞外微环境 (21)，改变整体组织力学特性并形成迭代反馈环路。再生芽基的基质来源力学信号可调控再生细胞的增殖、分化等行为 (24,25)，后续成纤维细胞凋亡等过程则会恢复组织稳态 (26)。但纤维化进程会绕过这些通路，导致组织结构的持续性破坏。鉴于成纤维细胞具有异质性 (27)，有证据表明特定亚型成纤维细胞具有内在的纤维化倾向 (28)，而这类成纤维细胞在再生组织中几乎不存在。纤维化与再生的 ECM 微环境也可能存在差异，进而介导截然相反的修复机制。

非再生与再生过程中的微环境分化

非再生性截肢后会出现纤维组织累积 (3)。本研究利用二次谐波生成（SHG）显微镜观察指端截肢后的胶原蛋白基质，发现非再生性伤口含有致密的类纤维化胶原蛋白，而这类胶原蛋白在再生芽基中几乎不存在。通过透射电子显微镜（TEM）验证胶原蛋白的结构特征，同样观察到非再生组织中存在排列更有序的纤维束。为探究介导胶原蛋白响应差异的 ECM 因子，本研究对非再生性伤口进行单细胞转录组分析，并将数据集与已发表的芽基与非再生数据集整合分析 (5,6)。为明确 ECM 合成的主要细胞类型，本研究基于核心基质组基因的表达量为每个细胞分配 ECM 评分，结果显示Pdgfrα阳性细胞簇的 ECM 活性最高，远超其他细胞簇。基因集富集分析表明，该细胞簇上调了 “胶原蛋白原纤维组装”“细胞外基质组装” 等 ECM 相关通路。由此推断，成纤维细胞是Pdgfrα阳性细胞簇的主要组分，也是构建胞外微环境的核心细胞类型。

鉴于成纤维细胞具有异质性，我们提出假说：非再生与再生指端的 ECM 差异源于细胞组成的内在区别。对Pdgfrα阳性细胞进行亚群分析，共鉴定出 8 种转录特征，其中成纤维细胞 1 型与 2 型在非再生组织中富集。不同伤口状态下的成纤维细胞亚型未表现出显著的转录差异，我们推测成纤维细胞 1 型与 2 型的富集与活性介导了纤维化响应。所有Pdgfrα阳性细胞簇的原纤维胶原蛋白表达水平相近，但非再生性伤口中胶原蛋白调控因子表达上调：如 * PDGFRα⁺CD34⁺CD31⁻* 成纤维细胞 1 型表达的肌腱蛋白 X（TNX）、SULF2⁺成纤维细胞 2 型表达的血小板反应蛋白 4（THBS4）。值得注意的是，芽基主要的成纤维细胞亚型 —— 成纤维细胞 3 型高表达肢体再生相关标志物（如Msx1、Mdk），但未差异表达核心胶原蛋白调控基因。综上，成纤维细胞 1 型与 2 型及其分别上调的 TNX、THBS4 是非再生组织的特征，提示胶原蛋白维持与重塑是驱动纤维化响应的关键。

鉴于纤维化是再生的对立面，我们提出假说：再生芽基中富集负责合成再生特异性 ECM 的细胞亚型。细胞亚型相关性与基因表达分析显示，成纤维细胞 1 型、2 型与成骨谱系（osteo- lineage，OL）细胞差异最显著，而 OL 细胞在芽基中的丰度约为非再生组织的 3 倍。此外，OL 细胞高表达胶原蛋白与蛋白聚糖，证实其是芽基中主要的 ECM 调控细胞。描述 OL 细胞的 ECM 相关基因本体论条目包括 “糖胺聚糖结合”“蛋白聚糖结合”“透明质酸结合”，提示芽基的 OL 细胞微环境以非胶原蛋白基质组分（尤其是透明质酸 HA）为核心。OL 细胞高表达软骨相关基因Acan、Col2a1、Hapln1及相关转录因子Sox6、Sox9。组织水平检测证实，再生组织中 OL 细胞更丰富，且与 HA 累积区域共定位，形成类似细胞外周被膜或糖萼的结构。芽基中的总 HA 含量显著高于非再生性伤口。由于 HA 可通过连接蛋白与蛋白聚糖结合，本研究检测了透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白 1（HAPLN1）与聚集蛋白聚糖（ACAN）的分布，发现二者在芽基中均大量富集。综上，芽基的 OL 细胞可合成大量由 HA、HAPLN1、ACAN 构成的基质，且不形成核心胶原蛋白基质，构建了再生过程中特有的 ECM 微环境。

鉴于胶原蛋白等 ECM 组分对组织力学特性的重要作用，本研究利用原子力显微镜（AFM）与力钳力谱成像技术检测受损指端的物理特性，发现非再生性伤口与再生芽基存在显著力学差异：非再生组织刚度更高、流动性更低，提示发生非再生与再生响应的指端具有截然不同的力学微环境。为探究这种微环境差异是源于 P2 与 P3 细胞的固有特性，还是伤口愈合过程中形成的，本研究对未受损的 P2 与 P3 指端进行单细胞分析，并将数据集与已发表的未受损、受损数据集整合。基线状态下，解剖位置是Pdgfrα阳性细胞的主要区分因素。损伤发生后，非再生与再生细胞均上调基质组基因，且二者的转录相似度高于与未受损细胞的相似度。但仅再生指端在截肢后 10 天（DPA）上调 HA，早期时间点与非再生指端的 HA 含量均极低。综上，细胞固有特性与损伤诱导的 ECM 重塑共同塑造了再生与非再生的独特微环境。

指端再生依赖透明质酸

鉴于再生芽基中富含透明质酸（HA），本研究探究指端再生是否依赖 HA。在第三指节远端（P3）截肢后，通过连续注射透明质酸酶降解 HA。截肢后 14 天（14 DPA），处理组指端长度显著缩短、面积减小；*RUNX2⁺成骨谱系细胞与细胞外周 HA 均减少，证实 OL 细胞与 HA 的关联性。为持续性清除 HA，本研究在小鼠饲料中添加 4 - 甲基伞形酮（4-MU），降低 HA 合成所需底物之一 —— 尿苷二磷酸葡糖醛酸的水平。胞外 HA 水平降低后，14 DPA 时处理组指端长度与面积均减小；28 DPA 时，对照组指端完成再生，而 4-MU 处理组指端仍显著偏小。进一步检测 4-MU 处理组指端的芽基状态，发现其整体下调芽基标志物芳基硫酸酯酶 I（ARSI）的表达。芽基的核心特征是增殖细胞富集，其中 OL 细胞的增殖活性极高，而 4-MU 处理显著减少了 Ki67⁺增殖细胞的数量。芽基细胞最终会分化为成熟组织，显微计算机断层扫描（μCT）结果显示，14 DPA 时再生指端发生骨组织解离（远端骨碎片排出导致骨缩短）并形成新骨；而 4-MU 处理延缓了骨组织解离介导的骨缩短，且未检测到新骨形成。28 DPA（再生基本完成）时，4-MU 处理组指端的骨体积、表面积与长度均显著低于对照组。再生指端中富集SP7⁺* 成骨细胞，而 4-MU 处理减少了成骨细胞数量；同时处理组指端沉积类纤维化胶原蛋白，提示修复轨迹向非再生 ECM 转变。综上，清除 HA 会阻碍 P3 远端截肢后的指端修复，其机制可能是抑制芽基形成与分化，证实 HA 在指端再生中发挥关键作用。

HA - 胶原蛋白平衡决定指端修复轨迹

鉴于 HA 与胶原蛋白在受损指端中呈负相关，且清除 HA 会诱导类纤维化 ECM 形成，本研究探究 HA 基质是否可阻断纤维化胶原蛋白组装。对比透明质酸酶处理组与对照组的胶原蛋白基质，发现透明质酸酶处理会增加胶原蛋白含量并诱导纤维化结构特征；4-MU 介导的 HA 清除也得到了相同结果。整体而言，破坏 HA 会形成纤维化胶原蛋白基质。由于胶原蛋白含量影响组织力学特性，我们提出假说：HA 清除后形成的纤维化胶原蛋白会改变组织力学特性。本研究在 P3 远端截肢前用 4-MU 干扰 HA 合成，检测组织刚度与流动性，发现 4-MU 处理组指端刚度更高、流动性更低，其粘弹性特征与非再生性伤口高度相似，证实 HA - 胶原蛋白相互作用可调控力学微环境。

为探究 HA 清除引发的组织力学改变对细胞行为的影响，本研究对 4-MU 处理组与对照组的 P3 远端截肢指端进行单细胞转录组分析，无监督聚类与数据集整合共鉴定出 9 种主要细胞类型。HA 清除显著降低Pdgfrα阳性细胞的比例，提示其损伤了典型的损伤诱导细胞扩增。对Pdgfrα阳性细胞的分析显示，4-MU 处理减少了 OL 细胞的比例；对比两组Pdgfrα阳性细胞的转录水平，发现成骨分化相关基因Ibsp、Alpl、Sox6及其靶基因Acan均下调，证实成骨分化受阻、软骨相关基质元件表达降低。值得注意的是，4-MU 处理组的Pdgfrα阳性细胞上调S100a4、Tnc表达，二者均与 ECM 刚度增加相关。这些基因也可在腱细胞中表达，但 4-MU 处理未诱导腱细胞相关基因特征，提示该转录转变并非腱向分化。此外，残留的少量Pdgfrα阳性细胞仍上调芽基相关基因，但其丰度极低，表明芽基转录特征未丢失，而是细胞扩增受阻。

鉴于 HA 清除会导致 P3 远端截肢后出现骨骼缺陷与成骨分化障碍，本研究探究 HA、组织力学与骨形态发生蛋白（BMP）通路的关联。与既往研究报道的 HA 与 Wnt 信号关联不同，本研究未观察到 HA 清除后芽基中 Wnt 信号激活的改变。因此，本研究检测 HA 清除（4-MU 处理）后组织中 BMP 通路核心效应分子 pSMAD1/5/8 的水平：对照组指端的 pSMAD1/5/8 水平随再生进程升高，而 4-MU 处理组则持续抑制 pSMAD1/5/8 表达。综上，OL 细胞不仅参与构建再生的 ECM 微环境，还对 HA 与组织力学改变高度敏感。

基质刚度介导细胞 - ECM 反馈

为解析力学信号与可溶性信号的互作机制，本研究制备坚硬与柔软的 StemBond 水凝胶，分别模拟非再生性伤口与再生芽基的力学微环境；同时添加芽基相关生长因子，检测二者对细胞响应的联合作用。柔软基质上的背部皮肤成纤维细胞经 BMP-7 处理后，细胞核内 pSMAD1/5/8 信号显著增强；免疫印迹实验进一步证实 pSMAD1/5/8 水平呈刚度依赖性变化。本研究还检测 DNA 结合 / 分化抑制因子（Id）的基因表达，以评估 pSMAD 的早期下游效应分子：Id1 表达受基质刚度调控，柔软基质上的成纤维细胞 Id1 表达水平最高。第二、三指节原代细胞的检测结果一致，柔软条件刺激下 Id1 表达上调最显著。水凝胶实验中各组基线 ECM 无差异，证实基质刚度可调控细胞对 BMP 配体的响应能力。

本研究进一步利用血小板衍生生长因子 BB（PDGF-BB，芽基损伤信号，具有强效 HA 合成激活活性），探究基质刚度对 HA 的调控作用。除Hapln1与Acan外，本研究还检测了 3 种透明质酸合成酶亚型：基质刚度对Has1-3表达的影响极小，且该实验条件下Acan对 PDGF-BB 与基质刚度均无响应；而柔软基质上的成纤维细胞经 PDGF-BB 处理后，Hapln1表达显著上调。鉴于 HAPLN1 可维持 HA 基质的结构完整性，本研究探究柔软条件是否能促进成纤维细胞组装细胞外周 HA 基质：PDGF-BB 处理后，柔软基质上的成纤维细胞在细胞表面合成更多 HA 与 HAPLN1 聚集体。柔软力学信号可促进促再生 ECM 合成，本研究进一步探究坚硬环境是否会增强非再生 ECM 合成，利用转化生长因子 β1（TGF-β1）与抗坏血酸诱导胶原蛋白合成。处理后，坚硬基质上的成纤维细胞合成原纤维胶原蛋白基质，且与 THBS4 共定位，二者均为非再生愈合的特征；而模拟芽基的柔软条件下，无论是否添加抗坏血酸与 TGF-β1，均未检测到 I 型胶原蛋白 - THBS4 网络形成。综上，HA 介导的组织柔软性可启动正反馈环路，增强 HA 基质合成；而坚硬基质则诱导胶原蛋白原纤维生成。

HAPLN1 促进非再生性截肢的修复

本研究进一步探究 HAPLN1 是否能促进细胞外周 HA 生成并影响胶原蛋白基质。HAPLN1 不仅与 HA 在芽基中大量共定位，芽基样的柔软基质也可促进二者合成。未受损指端检测显示，第三指节（P3）区域存在大范围的 HA 与 HAPLN1 富集区，而第二指节（P2）仅在骨膜等特定区域存在该富集区。实时荧光定量 PCR（qPCR）验证了 P2 与 P3 细胞中 HAPLN1 的区域表达差异。上述结果证实 HAPLN1 与 HA 在稳态与损伤状态下均高度相关，提示 HAPLN1 是介导 HA 富集的关键因子。为验证该假说，本研究在背部皮肤成纤维细胞中过表达Hapln1（Hapln1OE），并设置乱序序列为对照组（mCherry 对照）。将转染细胞培养于坚硬水凝胶上模拟纤维化力学环境，添加高分子量 HA 以促进细胞外周 HA 累积。尽管补充了 HA，mCherry 对照组成纤维细胞的细胞表面 HA 分布稀疏且有限；而Hapln1OE 组成纤维细胞合成大量 HAPLN1，且细胞外周 HA 显著增加。本研究进一步探究利用 HAPLN1 稳定 HA 基质是否能抑制刚度诱导的胶原蛋白原纤维生成：将转染成纤维细胞培养于坚硬水凝胶上，用抗坏血酸诱导胶原蛋白原纤维生成。Hapln1OE 组成纤维细胞累积大量细胞外周 HA，且胶原蛋白原纤维数量更少、长度更短，证实 HAPLN1 可促进 HA 沉积并抑制胶原蛋白原纤维生成，提示其在非再生环境中构建促再生 ECM 的潜力。

鉴于再生依赖 HA，且 HAPLN1 可稳定 HA 基质，本研究提出假说：在非再生性伤口中过表达Hapln1可启动修复性再生。为验证该假说，本研究对成年免疫缺陷小鼠进行非再生性截肢，将 mCherry 对照或Hapln1OE 成纤维细胞移植至指端。值得注意的是，Hapln1OE 成纤维细胞移植组在 28 DPA 时出现指甲再生，这一现象在非再生条件下从未发生。显微计算机断层扫描结果显示，Hapln1OE 成纤维细胞注射组的骨修复增强，骨延长与生长更显著；Hapln1OE 组的再生骨组织延伸至初始截肢平面以外，而对照组仅形成少量新组织。为证实该再生效应不依赖细胞移植，本研究向指端注射过表达Hapln1的慢病毒，同样观察到骨延长与骨痂体积增加。Hapln1OE 成纤维细胞减少了类纤维化胶原蛋白结构，促进 HA 与 HAPLN1 累积。鉴于 HA 与胶原蛋白可调控组织力学特性，本研究提出假说：HAPLN1 介导的 ECM 重塑通过改变微环境力学特性促进再生。原子力显微镜检测显示，与对照组相比，Hapln1OE 组截肢部位的刚度降低、流动性升高。

本研究最后探究 HAPLN1 介导的 ECM 调控对细胞活性的影响。鉴于Sox9在芽基中高表达，本研究将 SOX9 作为早期软骨成骨定向分化的标志物：mCherry 对照组成纤维细胞移植组的SOX9⁺细胞数量极少，而Hapln1OE 组的SOX9⁺细胞簇定位于截肢平面远端。本研究进一步检测分化程度更高的RUNX2⁺ OL 细胞：14 DPA 与 28 DPA 时，mCherry 对照组成纤维细胞移植组的RUNX2⁺ OL 细胞仅分布于原有骨皮质邻近区域；而Hapln1OE 组成纤维细胞在 28 DPA 时增加了RUNX2⁺ OL 细胞的数量，并使其向远端分布，与骨再生结果一致。此外，体外实验证实柔软基质可增强 BMP 信号响应，本研究检测 pSMAD1/5/8 水平，发现Hapln1OE 组的信号强度显著高于对照组。综上，HAPLN1 可介导 HA - 胶原蛋白基质重塑、软化组织微环境，进而启动非再生性截肢后的修复性再生。

为探究 HA - 胶原蛋白二分法是否存在于其他再生模型中，本研究分析了耳郭损伤、心肌梗死、骨折愈合三种再生模型的转录组数据集。尽管不同模型中 HA 相关酶、连接蛋白与受体存在差异，但再生转录程序均上调 HA 相关基因，下调纤维化特征性的原纤维胶原蛋白与交联基因。综上，不同器官可能通过组织特异性机制合成与重塑 ECM，但 HA - 胶原蛋白二分法是再生与纤维化愈合的共同特征。

讨论

近年来，我们对纤维化伤口愈合的认知快速提升 (2)，但脊椎动物复杂组织再生的调控因子仍不明确。研究难点之一在于，成年哺乳动物中缺乏可获取、稳定的组织再生模型。本研究通过探究成年小鼠指端截肢后的伤口愈合，解析了组织物理环境与再生、纤维化结局的关联。本研究鉴定出 ECM 及其介导的组织力学特性，是区分非再生与再生响应的核心特征。尤为重要的是，本研究发现再生芽基中富含 HA，且 HA 是再生的必需因子；HA 缺失会触发截肢指端向纤维化 ECM 与组织力学特性转变。基质力学特性反过来影响细胞对损伤信号的响应，我们认为这一过程通过反馈环路强化伤口愈合轨迹。本研究还证实，靶向 ECM 可实现非再生性截肢后的指端部分修复，为上述结论提供了实验支持。

成纤维细胞是 ECM 与伤口愈合的主要构建者 (20)。例如，梗死心脏中会出现特异性成纤维细胞，阻断免疫细胞对其的激活可减少瘢痕形成 (39)；类似地，机械性激活特定成纤维细胞中的Engrailed-1会驱动皮肤伤口瘢痕形成，抑制该激活过程可促进再生 (28,40)。本研究在上述研究基础上，同时解析了区分非再生性伤口与再生芽基的细胞与物理微环境。非再生条件下，两种特异性Pdgfrα阳性成纤维细胞占主导，通过合成胶原蛋白调控因子构建坚硬的胶原蛋白基质；而再生条件下，OL 细胞通过合成 HA 及 HA 相关组分（ACAN、HAPLN1），构建芽基柔软、高流动性的胞外微环境。上述结果揭示了再生与非再生过程中细胞与胞外因子的分化，以及二者的强关联性。同时，该发现强调了研究伤口愈合结局时，需同时考虑物理微环境与成纤维细胞多样性的重要性。

本研究通过 HA 干扰与挽救实验，证实 HA 是再生的必需因子。我们认为 HA 通过调控胶原蛋白原纤维生成与组织力学特性促进伤口修复，该现象在哺乳动物胎儿伤口 (14-16,41) 与其他物种 (25) 中均有报道，本研究在成年小鼠中的发现证实，HA - 胶原蛋白的相互作用在不同发育阶段的损伤中均保守存在，且可能适用于其他器官系统。但 HA 介导胶原蛋白组装的具体机制仍需进一步探究：一种可能是，庞大的细胞外周 HA 基质调控整合素与胶原蛋白的结合能力 (42)。尽管本研究未直接验证，但整合素介导的胶原蛋白结合是细胞感知与传递机械力 (43)、调控可溶性配体呈递 (44) 的主要方式，上述机制共同调控胶原蛋白重塑。同时，HA 基质可能通过空间位阻或限制前胶原蛋白扩散，物理性干扰胶原蛋白聚合物的自组装与有序排列 (45)。

本研究最后证实，ECM 与基质刚度可同时调控纤维化与再生。既往研究也将外源性物理力与细胞年轻化、再生相关联：例如，衰老引发的大脑硬化会损伤少突胶质前体细胞功能 (46)，抑制机械敏感性离子通道 Piezo1 可缓解这些细胞的衰老相关改变，增强其在脱髓鞘损伤后的再生能力 (46)；类似地，柔软基质可增强再生相关分子机制。本研究利用 HAPLN1 促进 HA 沉积、减少瘢痕并增强骨骼修复，将非再生性伤口的胞外环境改造为芽基样微环境。鉴于连接蛋白可稳定 HA 与蛋白聚糖的聚集体 (30,47)，我们认为 HAPLN1 可保护 HA 免受片段化降解（该过程常与炎症、纤维化相关）(48,49)。因此，HA 基质的高级结构组织是调控组织力学与生物学功能的重要因素。既往研究多强调生化信号或营养补充剂在组织再生中的作用 (50-52)，本研究数据证实，通过 HA 稳定性与组织力学调控物理微环境，也可提升再生效果。综上，联合物理与生化干预策略，有望成为促进哺乳动物组织再生的有效方法。

图 1：指端截肢后微环境区分再生与纤维化。（A）二次谐波生成（SHG）显微镜显示截肢后 14 天（14 DPA）非再生与再生指端的胶原蛋白纤维（白色）；虚线为指骨边界；右侧为非再生（NR）伤口与再生（R）芽基中胶原蛋白纤维数量的定量分析。（B）非再生与再生伤口的透射电子显微镜（TEM）图像。（C）14 DPA 时非再生伤口与芽基细胞的单细胞转录组测序（scRNA-seq）策略。（D）基于核心基质组基因表达的截肢后所有指端细胞的 UMAP 聚类图（ECM 评分）。（E）Pdgfrα阳性细胞的亚型分析（左）；主要差异表达基因（DEGs）点图及各亚型在非再生与芽基中的比例饼图（右）。（F-H）14 DPA 时 TNX（白色，F）、THBS4（白色，G）、HABP（品红色，H）的免疫荧光染色；绿色箭头为芽基中的 TNX 与 THBS4。（I）非再生与再生组织中每毫克总组织的 HA 总含量定量分析。（J）HA-HAPLN1-ACAN 复合物示意图。（K-L）14 DPA 时 HAPLN1（白色，K）与 ACAN（白色，L）的免疫荧光染色。（M）受损指端的原子力显微镜（AFM）刚度与流动性图谱（左）；品红色箭头为非再生伤口，绿色箭头为芽基；右侧为非再生与再生组织的刚度、流动性定量分析。

图 2：HA 是指端成功再生的必需因子。（A）P3 远端截肢后利用透明质酸酶降解 HA 的策略（左）；14 DPA 时对照组与透明质酸酶处理组指端的大体图像，绿色轮廓为指甲（右）。（B）14 DPA 时对照组与透明质酸酶处理组 HABP（品红色）与 RUNX2（白色）的免疫荧光染色（左）；处理组与对照组 RUNX2 阳性细胞比例、HABP 荧光强度、RUNX2 荧光强度的定量分析（右）。（C）P3 远端截肢后利用 4-MU 持续性清除 HA 的策略。（D）28 DPA 时对照组与 4-MU 处理组指端的大体图像，黑色轮廓为指甲。（E-F）14 DPA 时 ARSI（白色，E）与 Ki67（品红色，F）的免疫荧光染色；虚线为指骨边界；右侧为 4-MU 处理组与对照组 Ki67 阳性细胞、RUNX2⁺Ki67⁺细胞数量的定量分析。（G）28 DPA 时对照组与 4-MU 处理组指端骨骼形态的显微计算机断层扫描（μCT）分析；黄色箭头为骨延长，绿色箭头为骨残端。（H）28 DPA 时对照组与 4-MU 处理组 SP7（品红色）免疫荧光与 SHG 显微镜胶原蛋白纤维（白色）成像；橙色箭头为 SP7 阳性细胞核。

图 3：胶原蛋白 - HA 平衡决定纤维化与再生的转换。（A-B）P3 远端截肢后利用透明质酸酶（A）或 4-MU（B）清除 HA 的策略（左）；14 DPA 时胶原蛋白纤维（白色）的 SHG 显微镜成像（中）与纤维数量定量分析（右）；虚线为指骨边界。（C）14 DPA 时 4-MU 处理组指端的 AFM 刚度与流动性图谱（左）与定量分析（右）。（D）4-MU 处理组与对照组Pdgfrα阳性细胞的 UMAP 聚类图（上）；Pdgfrα阳性细胞的亚型检测（下）；各亚型主要差异表达基因及细胞比例饼图（右）。（E）4-MU 处理组与对照组Pdgfrα阳性细胞差异表达基因的火山图。（F）14 DPA 与 28 DPA 时 4-MU 处理组与对照组 pSMAD1/5/8 的免疫荧光染色（左）与荧光强度定量分析（右）。

图 4：基质刚度调控 ECM 合成与损伤信号响应的反馈环路。（A）利用 StemBond 水凝胶探究基质刚度对 BMP 信号影响的策略；坚硬基质（50 kPa）、柔软基质（0.7 kPa）上成纤维细胞 pSMAD1/5/8（白色）与 F - 肌动蛋白（品红色）的免疫荧光染色（中）；pSMAD1/5/8 荧光强度定量分析（右）。（B）Id1基因表达的 qPCR 分析。（C）P2 或 P3 细胞Id1基因表达的 qPCR 分析。（D）探究基质刚度对 PDGF-BB 信号影响的策略（左）；Hapln1基因表达的 qPCR 分析（中）；培养成纤维细胞 HAPLN1（绿色）、F - 肌动蛋白（黄色）与 HABP（品红色）的免疫荧光染色（右）。（E）HABP 面积定量分析。（F）利用 TGF-β1 与抗坏血酸探究基质刚度对胶原蛋白原纤维生成影响的策略（左）；成纤维细胞 I 型胶原蛋白（品红色）、F - 肌动蛋白（黄色）与 THBS4（品红色）的免疫荧光染色（右）；箭头为胶原蛋白 I 与 THBS4 区域。（G）ECM、组织力学与Pdgfrα阳性细胞反馈环路的工作模型。

图 5：HA 累积促进非再生性截肢后的指端修复。（A）坚硬环境中过表达Hapln1（Hapln1OE）的策略（左）；mCherry 对照组与Hapln1OE 组成纤维细胞的 HAPLN1 免疫印迹，及每个视野 HABP 覆盖面积定量分析（右）。（B）探究Hapln1OE 对胶原蛋白原纤维生成影响的策略（左）；HABP（品红色）与 I 型胶原蛋白（白色）的免疫荧光染色（中）及胶原蛋白纤维数量定量分析（右）；箭头为胶原蛋白 I 与 HABP 染色区域。（C）诱导非再生指端修复性再生的策略。（D）28 DPA 时指端 μCT 扫描、盲法分割图像（红色）及新骨长度定量分析。（E）28 DPA 时指端胶原蛋白纤维（白色）的 SHG 显微镜成像及纤维数量定量分析；虚线为原有骨皮质（绿色）与新骨形成（品红色）。（F）14 DPA 时Hapln1OE 组与对照组指端的 AFM 刚度、流动性图谱（左）与定量分析（右）；虚线为 P2 骨。（G）28 DPA 时指端 RUNX2（黄色）与 K14（品红色）的免疫荧光染色（左）；虚线为 P1（青色）与 P2（绿色）；红色线为截肢平面；RUNX2 阳性细胞比例与 pSMAD1/5/8 荧光强度定量分析（右）。