死后复苏

饶

机器翻译2026年07月19日约 23 分钟

死后视网膜复苏

Eimear M. Byrne, Umberto Di Vicino, Nairouz Farah, Marta Cadevall Angles，

Manuel Fernández Merino, Mikhail Rotkevich, Daniel Caravaca Rodriguez, Mark

Balashov, Miguel Guerra Solano, Mohammed Salim Ibrahim, Jose Alejandro Marin

Figuera, Javier José Puig Galy, Alberto Sandiumenge, Ricardo Casaroli

Marano, Jack Lee, Yossi Mandel, Maria Pia Cosma.

摘要

视力丧失损害了全球数百万人的生活质量。目前，尚缺乏恢复视力的疗法。人眼的死后保存可能有助于实现全眼移植（whole eye transplantation，WET）或治疗开发。我们开发了一种方法，通过定制的装置“眼护理盒”（ Eye-in-Care-Box，ECaBox）对眼动脉进行插管并灌注离体猪眼和人眼。利用监督式深度学习模型，通过视网膜血管成像和重建来评估灌注效果。在无干预情况下，视网膜在死后会发生降解；而灌注可在长达24小时内保持视网膜结构和细胞活力。眼球在摘取后30分钟内接受灌注，并在死后长达10小时内恢复光反应，这挑战了“光反应在死亡时即终止”的传统观念。我们的研究结果表明，完整的眼球可在体外被复苏并保存，这为ECaBox平台用于全眼移植保存和临床前治疗测试提供了支持。最终，ECaBox有望为患者带来恢复视力的治疗。

引言

视网膜（retina）是位于眼球后房的分层神经组织，负责将光信号转化为神经信号并传递至大脑。它具有高代谢需求和无血管区，其功能在很大程度上依赖于结构完整性的维持。因此，与其他器官相比，在体外将视网膜保持在完整眼球内面临着独特的血管和代谢挑战。

不可逆的视力丧失可由多种原因引起。创伤性视力丧失在年轻人中常见，且常导致不可逆失明。导致失明和视力损害的主要疾病是白内障、视网膜退行性疾病{包括青光眼、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）}。白内障可通过手术干预治愈，而当前疗法仅能延缓退行性疾病的进展。例如，抗VEGF抗体是年龄相关性黄斑变性的既定治疗方法，但其疗效有限且伴有显著风险。视力丧失也可继发于全身性疾病，如糖尿病、高血压、栓塞性疾病、自身免疫性疾病和缺血性疾病。此外，导致视网膜色素变性和Stargardt病的遗传突变也是视网膜变性的重要原因。目前对这些视网膜退行性疾病的疗法在延缓疾病进展方面有一定效果，但无法完全恢复视力。由于人类视网膜缺乏再生能力，目前正处于临床试验或临床前验证阶段的疗法旨在恢复视力，包括细胞替代疗法、视网膜假体、光遗传学和基因疗法。尽管取得了一些有前景的进展，但这些疗法的疗效仍然有限。全眼移植（whole eye transplantation ，WET）可能提供另一种解决方案。然而，虽然心脏、肺、肾、肝、胰腺和肠等实体器官移植已经实现，但全眼移植长期以来被认为在医学上不可行。近期，在一项开创性临床研究中，眼血管再灌注的可行性得到了证实，为未来眼移植成为恢复视力的临床干预手段带来了希望。然而，由于视网膜、视神经和中枢神经系统即使面对短暂的缺血也极为脆弱，要实现伴有视力恢复的全眼移植，需要开发创新技术和手段，突破长期塑造眼科学研究领域的传统范式。

除了在全眼移植中的潜在应用外，离体保持眼球对于临床前测试也极具价值，后者通常使用啮齿动物进行。由于小鼠视网膜缺乏黄斑样结构——而黄斑是人类视网膜变性的主要部位——因此需要使用人类或大型动物眼球。当视网膜从眼杯中分离并在生理平衡的含氧培养基中维持时，可检测到光反应。然而，在无循环灌注的情况下，人类视网膜会迅速丧失光反应能力。迄今为止，尚不清楚完整眼球离体而非分离视网膜能否保留视网膜功能，如先前报道所示。通过眼球自身循环恢复视网膜功能对于模拟全眼生理以及推进移植和临床前应用至关重要。然而，这是一项特别困难的任务，因为向死后眼球内的视网膜输送营养物质和氧气面临诸多挑战。我们假设，如果人眼能在体外维持在生理条件下，则视网膜活动可以在离体完整眼球中得以保留。

为验证这一假设，我们使用了猪眼，因其在解剖学上与人类眼球相似。首先，我们开发并验证了血管插管和灌注策略。随后，我们证明，用含氧溶液对整个眼血管系统进行离体灌注足以在死后长达10小时内挽救视网膜电生理功能。此外，我们还在人眼上验证了我们的插管和灌注方法。综上所述，ECaBox系统通过有效灌注，在死后保存了视网膜结构和活力。因此，尽管摘除后经历了一段缺血期，但完整眼球的视网膜功能仍保持完好。我们设想，ECaBox系统通过复苏眼球，可应用于离体视网膜疗法的测试，并有望用于恢复视力的全眼移植。

结果

设计用于离体眼球护理的系统（ECaBox）

我们假设，通过生理循环恢复视网膜组织的灌注可以恢复功能，从而使眼球复苏。此外，我们认为，为保持眼球功能，必须维持视网膜和脉络膜血管系统的血流动力学功能。通过优化先前报道的方法，我们为猪眼和人眼开发了插管（cannulation ）和灌注（perfusion）策略，并整合了临床成像技术来评估视网膜灌注效果。

为便于随时间推移进行再灌注和眼评估操作，我们迭代设计了眼球支持系统。最终获得了一个可密封的系统——ECaBox（眼护理盒Eyes in a Care Box），其配备有用于光学相干断层扫描和视网膜眼底成像的观察窗。系统中还集成了一个闭环灌注回路和一个能够通过实时传感器动态调节压力和流量的控制系统。此外，ECaBox还配备了OCT、眼底成像和荧光素血管造影功能。

在猪眼摘取后不久，我们识别了眼动脉，并将其解剖以便放置26G套管。为在再灌注条件下研究眼球，我们开发了眼球支撑架和卡扣式套管支撑。该支架确保在眼球灌注期间，套管在操作过程中不会移动或从血管中脱出。成像窗口和模块化闭合组件便于该盒子用于不同实验问题。所有组件的细节见分解图。

整个血管系统可在离体插管眼球中高效灌注

以0.5 mL/min的恒定流速进行灌注，可在60分钟内维持稳定的灌注压。同时，眼内压逐渐升高，随后达到接近猪正常眼压范围（约20-25 mmHg）的平台期。为评估ECaBox灌注策略的效果，在室温下通过视网膜眼底成像和荧光素血管造影评估了视网膜血管再灌注。成像显示，在插管良好的眼球中，约90%的动脉和静脉血流得以恢复。OCT成像显示，灌注5分钟后，视网膜鼻侧血管和脉络膜颞侧血管充盈，且大多数灌注眼球无视网膜水肿，表现为灌注后视网膜厚度无变化。

在建立插管策略后，我们进行了血管铸型，以绘制离体眼球内的全部血管。具体而言，用BriteVu铸型试剂灌注眼球，固定后通过X射线微型计算机断层扫描成像。利用Micro-CT，可分辨单个灌注血管，整个眼血管系统（包括视网膜、脉络膜和虹膜）均被铸型材料有效填充。利用Attention U-Net监督式深度学习模型，可对血管进行分割和重建。血管被分割以识别中心线和直径，并通过后处理进一步优化初始树状拓扑结构（去除伪连接并重新连接中断片段）。具体地，识别出小型环形血管，进一步分析发现处理伪影并予以去除。然后，匹配邻近末端片段以恢复连接，与未修改片段共同构成最终输出。由此建立了眼血管重建流程。

为进一步确认Micro-CT分辨率以下的细小毛细血管是否也被灌注，我们使用共聚焦显微镜检查了视网膜。铸型材料在视网膜微血管中清晰可见，证明其被有效灌注。共聚焦视网膜图像的放大区域显示灌注可达毛细血管水平。自动分割进一步证实了毛细血管灌注的清晰度。

在遵守伦理限制的前提下获取并提取保留完整眼动脉的人眼，在操作上具有挑战性。尽管如此，我们通过适应先前方法和我们为猪眼开发的方法，建立了一种人眼摘取方案。在插管并灌注人供体眼球后，我们成功进行了视网膜眼底成像，显示白色铸型材料充盈的血管灌注。此外，通过OCT，我们在视网膜血管中观察到白色铸型材料，提示人眼视网膜的有效灌注。

基于AI的血管解剖重建与量化

尽管全局血管铸型在多个样本和不同死后时间点均成功完成，但我们观察到渗透程度存在一定差异。为定量比较不同死后时间灌注的眼球之间的这些差异，我们使用Attention U-Net模型生成了详细的血管解剖重建。对眼球进行了整体分析，以及分区分析（按八分区，图3b），并按血管半径分组。样本根据死后铸型时间分为早期（≤5小时）或晚期（≥10小时）组。在每个样本中，量化了每个八分区内血管节段的总长度和总体积，然后除以分区表面积以校正眼球大小差异。该分析表明早期组的血管密度更高。与早期组相比，晚期组的全局总血管长度密度较低。晚期死后时间点的总血管体积也出现类似减少。按血管半径对血管长度进行细分，以评估不同大小的血管。晚期组在0-20 μm和40-80 μm半径类别中的血管长度短于早期死后组，其他半径类别也呈现相似趋势。这些数据表明，与早期死后时间点灌注的眼球相比，在较晚死后时间点（>5小时）灌注的眼球的眼血管可能在死后随时间推移丧失完整性。当单独检查各八分区的长度密度和体积密度时，晚期组所有区域的长度和体积均呈减少趋势，其中大部分（但非全部）区域显示统计学显著减少。

未灌注死后眼球的视网膜结构

为确定最能保持视网膜活力的策略，我们首先通过组织学分析视网膜结构，表征了离体完整眼球随时间变化的视网膜退行性变化。我们推测，至少需要24°C才能用于离体眼球的临床前治疗评估，特别是当使用电生理学评估功能时。此外，先前有报道称，与37°C相比，在室温（24°C）下维持时，离体视网膜的光驱动活动可延长。

猪眼摘取后立即在室温下保存3、10或24小时，然后固定。从完整眼球分离的视网膜在死后10小时内结构保持完好。然而，24小时时出现退行性改变，表现为核层（内核层、外核层）不规则和进行性变薄。当我们对视网膜退行性严重程度进行分级时，在死后10小时内未观察到显著差异，而24小时时视网膜显著退变。重要的是，视网膜色素上皮形态在早期（3小时）和晚期（24小时）死后时间点均保持良好，提示在这些时间点无明显的（retinal pigment epithelial，RPE）形态异常。

视网膜退行性严重程度也通过基于AI的评分方法得到确认。我们训练了一个EfficientNet-B0模型，该模型可将视网膜切片准确分为四类：基线、轻度、中度和重度。特征空间分析显示四个紧凑的簇，与组织病理学标签和网络预测一致。基线样本在图顶部占据一个紧密、明确的区域，而严重程度类别从轻度经中度到重度在下方呈连续放射状分布，重现了视网膜退变的自然进程。95%置信椭圆进一步表明基线和严重组织形成分离的簇，而轻度和中度类别显著重叠，反映了中间阶段组织病理学分级的固有模糊性，这与临床实践中观察者间变异性一致。值得注意的是，模型对死后3、10和24小时的预测与真实标签趋势相似，显示在较晚的死后灌注时间点向更严重退变状态的偏移。最后，梯度加权类激活映射显示模型最高的注意力权重位于光感受器外核层和内丛状层区域，而这些区域已知会发生退行性改变。激活模式显示健康切片中板层结构完整，而严重病例则聚焦于细胞破坏和组织缺失区域，表明我们的视网膜退化评估具有稳健性。

接下来，我们研究了低温对组织保存的影响。大型器官通常在4°C下保存，以在移植前降低代谢活性和细菌增殖。尽管低温通常会抑制视网膜功能，但我们检查了低温是否能保持死后不同时间点的视网膜结构、蛋白表达和活力。我们发现，在4°C和24°C保存的眼球中，24小时时的结构退化均显著比3小时更严重，表明冷保存不足以保持视网膜组织结构。

蛋白质分析显示，在4°C保存下，死后3、10和24小时之间的整体视网膜蛋白表达无变化。视网膜神经元和胶质细胞标志物（如Vimentin、GFAP和Rhodopsin）以及细胞死亡相关蛋白在这些时间点均未发生改变。然而，在4°C下24小时后，细胞大小和细胞活力均显著降低，表明4°C保存不足以保持死后眼球中的视网膜。尽管在死后第一天4°C下整体蛋白表达在组织中保持稳定，但无论4°C还是室温下，死后24小时视网膜活力均受损。因此，为复苏眼球，需要在死后24小时之前进行再灌注等干预以避免损伤。

灌注可挽救死后眼球中的视网膜活力

随后，我们检测了用含氧林格氏液灌注是否足以复苏并维持死后眼球中视网膜的存活。我们将两组眼球维持24小时（一组无灌注，另一组用林格氏液灌注），并与死后3小时无灌注的眼球进行比较。与未灌注眼球相比，林格氏液灌注的眼球在死后24小时视网膜结构退化严重程度显著降低。该结果也通过EfficientNet模型的预测得到确认。我们训练好的模型不仅正确分类了随死亡时间增加而加重的损伤严重程度，还分类了灌注后的逆转状态。模型预测10小时未灌注和24小时灌注眼球的轻度和中度退化图像比例相当，表明与24小时未灌注眼球相比有所改善。林格氏液灌注也足以挽救细胞活力和视网膜细胞大小。通过流式细胞术分析解离视网膜中Calcein标记的活细胞，进一步证实了林格氏液灌注对细胞活力的保护作用。总体而言，在灌注下维持至死后24小时的眼球，其活力显著高于相同时间无灌注的眼球。这些数据通过比较6位人类供体的对侧眼（灌注与未灌注）得到验证。我们比较了来自同一供体的对侧眼在获取样本后3小时（一只灌注，另一只无干预）的视网膜细胞活力。灌注挽救了视网膜细胞活力，其变异性归因于供体的异质性。

离体眼球复苏可达死后十小时

接下来，我们测试了离体眼球再灌注后的视网膜功能。我们旨在评估灌注眼球中的视网膜是否对光刺激有反应。因此，我们承担了在光刺激后从完整离体眼球测量视网膜电图（electroretinograms，ERG）这一具有挑战性的任务。先前报道表明，氧气是神经元功能的关键参数，而氧水平降低会导致ERG振幅降低。这表明血氧与ERG反应密切相关，且视网膜在较宽的氧饱和度范围内均有反应。为确定恢复眼球灌注是否能恢复视网膜的电生理反应，我们使用含氧林格氏液灌注离体眼球，并在摘除后随时间测量ERG反应。阳性反应定义为存在特征性且重复的ERG波形，其幅度高于噪声水平2.5个标准差。阴性信号没有重复波形。重要的是，ERG幅度随光强度增加而增加，在较高强度下达到饱和。在36只灌注眼球中，有15只（41.6%有反应）在用含氧林格氏液灌注期间检测到ERG信号。ERG幅度在灌注期间非常缓慢地下降，可持续长达10小时甚至12小时，最终达到平台期。在一些眼球中，记录因后勤原因而停止，而非眼球停止反应。离体ERG信号在来自15只动物的眼球中均被观察到，表明离体眼球的反应能力并非个别动物生理学所特有。未灌注眼球的ERG信号因摘除期间的缺血而迅速衰减，与先前报道一致。这些结果突显了ECaBox策略通过灌注一种易于制备的生理溶液，在死后维持眼球功能长达10-12小时的能力。值得注意的是，在开始灌注后的前15分钟内，所有眼球均未观察到ERG反应，信号接近噪声水平，这与灌注启动后活动的逐步复苏一致。在三只眼球中，一旦离体灌注建立了稳定的ERG信号，我们关闭了灌注。如预期那样，这导致ERG反应下降并最终停止。当恢复灌注时，ERG信号恢复，进一步表明视网膜活动的复苏依赖于灌注。未来对整个灌注系统（包括灌注液）的优化可能会使ERG信号持续更长时间。最后，我们评估了离体眼球中ERG反应变异性的可能原因。在有反应和无反应的眼球之间，缺血时间（即从摘除到再灌注的时间）无显著差异。有反应眼球的基线体内ERG幅度与离体反应持续时间相比，呈非常弱的正相关或无相关性。此外，我们还比较了后续离体有反应和无反应眼球之间的初始体内眼压值，发现无显著差异，表明预先存在的眼压不是ERG反应差异的原因。所有眼球在离体记录前均进行了体内ERG记录。离体ERG有反应和无反应眼球之间的基线ERG幅度无显著差异。这些结果表明，其他因素决定了离体ERG反应，未来需要进一步研究以确定成功复苏离体眼球视网膜的最关键参数。

讨论

世界卫生组织估计，全球至少有22亿人受视力丧失影响。目前缺乏能够恢复视力的疗法。在本研究中，我们提出了一种独特的策略来解决这一未满足的临床需求。具体而言，我们利用外科手术方法、眼科成像、活力研究、结构分析、电生理学和血管建模，来确定眼球在体外存活的条件。我们提供了探索摘除后完整眼球中视网膜状态的数据，以及一种在死后眼球中复苏视网膜功能的策略。

我们证明，死后猪眼可在ECaBox系统中被复苏。猪眼包含“视觉条纹（visual streak）”——一个负责敏锐、精细中心视力的类中央凹区域，并且具有与人眼相似的血管组织和视网膜大小。因此，ECaBox系统中的猪眼提供了人眼解剖学的可靠模型，从而有助于在进展至活体动物和患者之前，在离体完整眼球中评估治疗方法。此外，猪眼为临床前测试提供了一种符合伦理和可持续性的模型，因为它们与人眼相似且是肉类产业的副产品。因此，我们的研究通过引入一种减少对活体动物实验依赖的替代方法，支持了3R原则。

我们在完整死后眼球中实现视网膜复苏的实验数据，是向通过全眼移植恢复视力目标迈进的重要里程碑。我们发现，完整眼球中的视网膜在离体数小时内受光刺激可引发神经元反应，这与先前在分离视网膜和视网膜类器官中的研究以及近期在一例并侧面部同种异体移植和眼再灌注患者中观察到的光反应一致。尽管目前患者尚无法通过眼移植恢复视力，但这是一个卓越的概念验证。血管造影显示视网膜灌注成功、眼球体积维持，更重要的是，记录到电活动表明视觉皮层对光刺激有反应。然而，该患者仍无法通过移植眼看见东西，凸显了视网膜组织的脆弱性。

ECaBox眼球维持策略的新颖之处在于，它可将完整眼球在死后保存长达24小时，并在体外独立于血液的情况下，使光反应复苏长达10-12小时。ECaBox允许通过实时成像和电生理记录在完整眼球中持续监测视网膜结构和功能。我们表明，通过眼动脉的生理灌注，视网膜可以恢复光反应，而这种反应在眼杯制备中无法实现。在视网膜外植体系统中，电极直接接触视网膜。相比之下，在我们的全眼系统中，光反应通过外部角膜电极检测，正如在人类患者中那样。离体完整灌注眼球记录的信号强度，是视网膜存活和功能活动的明确指标。它不能直接与体内或视网膜外植体的离体记录相关联，因为幅度高度依赖于ERG系统设置、噪声隔离条件、电极接触和生物系统——所有这些在本研究中均针对兽医手术室中离体眼检查的独特环境进行了调整。

因此，虽然先前的研究和我们的研究都支持“及时供氧可恢复死后视网膜活动”这一更广泛的概念，但我们的方法确立了通过血管介导的完整眼球复苏的原理验证，代表了概念和技术上的关键进步。

先前报道的眼动脉插管仅限于眼的程序性或解剖学特征描述，而ECaBox允许在完整眼球中通过实时成像和电生理记录持续监测视网膜结构和功能以及血管完整性。在捐献后尽可能长时间地保持视网膜功能，对于在常规临床环境中促进全眼移植至关重要（因为并排供体和受体是不切实际的）。随着ECaBox系统和富含营养的灌注液的未来发展和完善，应该可以实现完整眼球中视网膜的更长时间离体维持。

人类供体在高龄和合并症方面存在显著异质性，这限制了获得统计学显著数据的能力。此外，本研究中人供体眼数量较少的主要原因之一是与组织捐献相关的伦理挑战。目前，我们只能获得不适合角膜移植的人体组织，因为供体角膜的医疗用途优先于研究用途。现在，我们有了坚实的证据表明可以复苏猪眼，并且有充分的理由尝试在人眼中进行同样的操作，我们更有可能获得使用心脏跳动供体眼球的批准，这些眼球通常为移植目的而摘取。这类供体的眼球也将使我们能够对人离体眼进行ERG实验。我们正在计划开发一种便携式手术室ECaBox，以在心脏跳动供体眼球可用时最大程度地减少其缺血时间。

在本研究中，我们还提供了整个眼血管系统的详细重建，这将使未来能够完善血管结构和分支连接性的模型。这将通过实现对特定样本的模拟流动分析，为进一步优化灌注条件提供机会。详细的血管解剖图谱是未来建立数字孪生能力以模拟正常和疾病状态的关键组成部分，这将有助于在ECaBox维持的眼球中进行验证之前，进行疗法的计算机模拟预测、先进灌注策略和药代动力学研究。

我们的数据还表明，灌注可在缺血后保持视网膜活力，这与临床观察一致，例如一过性黑蒙（Amaurosis fugax）——一种由视网膜血流暂时性阻塞引起的短暂视力丧失，一旦正常血流恢复，视力即可恢复。类似地，人类中可发生暂时性可逆视力丧失，如视网膜偏头痛、视网膜血管痉挛、视网膜中央动脉阻塞、癫痫发作和Uhthoff现象。然而，在视网膜中央动脉阻塞后，如果在90分钟内未恢复灌注，视力恢复非常有限。这些先前报道表明，整个视觉系统对缺血具有一定程度的耐受性，这与本研究中报告的光反应复苏一致。

最后，我们的研究为缺血后脑保存提供了重要考量。事实上，虽然电生理反应在缺血时丧失，但我们表明，使用含氧溶液可以在神经视网膜中挽救这些反应。这一发现可能促使对临床方案和围绕再灌注用于逆转脑死亡效用之现有范式的重新审视。

总之，本报告中描述的ECaBox灌注和监测方法表明，死后可通过眼球自身循环恢复视网膜光反应。ECaBox可在全球范围内用于临床试验前的新型临床前疗法的评估，以及在临床实践中用于全眼移植的改进保存。我们的发现代表了相对于现有方法的重大概念和技术进步，提供了一种生理学完整的死后眼球复苏模型，并为未来的移植和治疗研究奠定了基础。最终，ECaBox将为患者带来恢复视力的治疗。

方法

[方法部分依次包含：ECaBox设计、打印与组装；从屠宰场获取猪眼；获取供体同意书程序；人眼摘除；猪眼和人眼的插管与灌注；猪眼血流动力学记录；OCT和视网膜眼底成像；Micro-CT；血管分割AI模型；区域性血管网络评估；离体视网膜的石蜡处理；RPE铺片的免疫染色；RPE细胞形态分析；组织学分级；基于AI的视网膜结构退化分类及可解释AI分析；流式细胞术；手术环境下猪眼的获取与灌注；视网膜电图；ERG数据分析；眼内压记录；蛋白质组学样品制备；色谱与质谱分析；数据分析；统计分析。略]

图注（注意：下载论文图与页眉重叠）

图1. 插管策略及眼护理盒设计。
(a-c) 密封的ECaBox装置。(a) 流出灌注液的路径（高亮显示）。用户通过连接的三通旋塞控制流出液收集。(b) 盒子前部显示闭合机构和OCT窗。(c) ECaBox系统的分解图。1 = 盖子，2 = 主体，3 = 眼床，4 = 底座/引流系统，5 = 底座支架，6 = 标准实验室管接口，7 = 窗框，8 = 窗玻璃，9 = 窗垫圈，10 = 上垫圈，11 = M3螺丝，12 = 轴杆，13 = 底部垫圈。(d) 摘除并切除肌肉以暴露眼动脉的猪眼（黑色箭头）。(e) 动脉壁和动脉口，进一步解剖后用于插管。(f-g) 放置在定制眼支架中的猪眼，带有套管支撑（26G套管插入眼动脉），(f) 侧视图，(g) 俯视图。

图2. 猪眼离体灌注的验证。
(a) 进行性血管灌注的视网膜眼底荧光素血管造影图像。每张图像上方标注从荧光素灌注开始的时间（秒），(n ≥ 4)只猪眼。第一张图像中标尺1 mm适用于后续所有图像。(b-c) 全眼球血管铸型的代表性Micro-CT图像，显示脉络膜和视网膜血管系统的灌注。(b) 灌注和血管铸型后的单血管分辨率。(c) 死后3小时，全眼球血管铸型，(n ≥ 4)只猪眼。(d) AI分割和重建的眼血管系统。(e) 完整视网膜z-堆栈的共聚焦最大强度图像，视网膜神经节细胞面朝上，显示血管铸型后的微血管灌注。(f) 从(e)所示完整视网膜共聚焦图像裁剪的区域，及其对应的(g)算法重建版本。

图3. 早期（≤5小时）和晚期（≥10小时）死后眼球中的血管参数。
(a) 早期和晚期死后猪眼前房和后房的全血管几何形状样本。(b) 眼球八分区和靶心示意图。(c) 早期和晚期组样本的总血管长度和(d) 血管体积表示为分区表面积的密度，(n = 3)每只猪眼。每只眼用一个点表示。(e-j) 早期时间点（<5小时）以天蓝色小提琴图显示，晚期时间点（>10小时）以深蓝色显示。(e) 总血管长度归一化于表面积。(f) 总分区血管体积归一化于表面积。(g-j) 不同血管半径组的总血管长度密度归一化于表面积：(g) 0-20, (h) 20-40, (i) 40-80, (j) 80-160 μm。数据通过学生t检验比较，*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01。

图4. 死后最初24小时内的视网膜结构和细胞活力。
(a) 在室温（24°C）下，无灌注维持死后3、10或24小时，或林格氏液灌注（0.5 mL/min）维持24小时的视网膜中央区代表性图像。(b) 从死后3、10或24小时保存的眼球中H+E染色视网膜切片的视网膜退化分级。检查中央、中部和周边区域。x轴表示死后时间间隔，小提琴图颜色表示无灌注（蓝色）和林格氏灌注（黄色）。每个小提琴图内的白点表示一只猪眼，（3h、24h、24h林格氏，每群n=9-20只猪眼，10h n=3）。(c) EfficientNet-B0特征的PCA显示四个严重程度簇的真实标签和预测标签。(d) 用于评估训练模型性能的最佳折测试数据集的真实标签分布。未灌注3h、10h和24h及灌注24h死后眼球组分别包含45、18、47和12张图像。仅包括视网膜中央区域的图像。(e) 训练好的EfficientNet-B0模型对同一测试组的预测标签分布。(f-h) 从在24°C下不同死后时间间隔保存的完整猪眼中分离的视网膜单细胞检查细胞活力。(f) 死后3h、24h或24h林格氏灌注（500 μL/min）后解离视网膜细胞的细胞计数。每只眼至少计数496个细胞，多数样品计数超过20,000个细胞。(g) 相同时程内细胞大小变化的比较。(h) 使用Calcein作为活细胞标记物并通过流式细胞术分析活/死细胞，归一化于总细胞数。(f-h) 每个小提琴图内的点表示一只眼，(n=3-6)每群猪眼。(i-j) 人类供体对侧眼细胞活力比较。通过配对t检验比较对侧眼在灌注林格氏液3小时或无灌注后的细胞活力，通过(e) Countess细胞计数（n=5只人眼）和(f) 流式细胞术检测Calcein阳性活细胞（n=6）。>3个变量的数据通过单因素方差分析，人对侧眼通过配对t检验比较，ns: P > 0.05, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001。

图5. 死后不同时间灌注眼球的视网膜电生理。
(a) 氧合、眼摘取、插管、灌注和ERG的示意图，包括镊子、弹簧剪和缝线等工具。插管和灌注在摘取后30分钟内完成。(b) 记录窗口显示一只ERG阳性灌注眼球的代表性记录，在摘除后不同时间点刺激，显示出特征性信号，幅度（峰-峰）稳定，持续超过3小时。(c) 记录窗口显示一只灌注眼球在摘除后不同时间点无ERG反应的代表性波形。(d-g) 每张图中的单个点表示ERG幅度，由每个摘除后时间点30次重复记录的平均波形最大值与最小值之差计算得出。(d) 离体完整眼球在长达10小时林格氏液灌注下的总体光反应。所有灌注眼球的ERG幅度，颜色表示个体眼球，平均反应用黑色实线表示（n=15只猪眼），噪声水平用黑色虚线表示。(e) 所有灌注眼球（黄色星号）和未灌注眼球（灰色菱形）归一化平均ERG幅度的线性外推，灌注眼球的指数衰减拟合（黑线）与未灌注眼球的平均拟合（蓝线）比较。插图：摘除后T=0:2.5小时的放大图，突出显示未灌注眼球信号丧失显著更快。n=15只灌注猪眼，n=5只未灌注猪眼。(f) 灌注与未灌注眼球平均估计衰减时间（分钟）（均值±标准差），n=15只猪眼。(g) 三只光反应持续至少10小时的眼球中一只的代表性ERG幅度。当灌注关闭时（灰蓝色背景）光反应丧失，当灌注流动时（白色背景）恢复。n=3只灌注猪眼。