T细胞剿匪记：补充实验带来的峰回路转

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导读： 一个看似无关紧要的补充实验，可能带来怎样的奇迹？美国宾夕法尼亚大学助理教授马乐园就在补充实验的旅途中迎来了自己的“尤里卡时刻”。 踏足学科交叉的未知领域，机会总是与风险并存。 但有勇气和毅力，以及对探索未知的热情和动力，就有可能做出新的发现
黄宇翔 ｜撰文 陈晓雪 ｜编辑 1 2019年6月的一天，看到电脑屏幕上的荧光信号数据，马乐园又惊又喜：眼前的实验结果，推翻了他的猜想，显示在CAR-T疫苗和外源CAR-T细胞的共同刺激下，内源T细胞的数目增加了百倍以上！ 他立刻意识到，这一出人意料的补充实验结果背后，可能隐藏着一个重要的新发现。 这个实验，是他博后阶段一项投稿工作的收尾实验，以应对审稿人三个月前提出的几个疑问。 自2017年1月加入美国波士顿麻省理工学院Koch研究所的Darrell Irvine实验室，马乐园花了两年的时间设计出了一款“CAR-T细胞专属疫苗”，简称CAR-T疫苗，其能够显著增强CAR-T细胞杀伤实体瘤的能力。 CAR-T细胞疗法是一种新兴的肿瘤免疫技术，研究者通过基因改造设计出能定向识别肿瘤细胞抗原的免疫T细胞（简称为CAR-T细胞），并将其输入患者体内实现对癌细胞的清剿。但一直以来，CAR-T疗法在治疗实体瘤过程中的临床表现远逊于其在液体瘤中的表现。 在博士阶段就已经熟悉肿瘤治疗领域的马乐园清楚这背后的原因，其中一个就是CAR-T细胞在进入体内后，会随着循环系统四处“巡逻”，在经过肿瘤病灶附近时，只有检测到肿瘤抗原，才会停下脚步进入病灶执行清除肿瘤的任务，而大部分没有检测到肿瘤抗原的CAR-T会回到各个淋巴结的大本营集结待命。 如果能人为地向CAR-T细胞驻扎的“大本营”（即各个淋巴结）输送一个模仿肿瘤抗原的分子，是否能够动员起更多的CAR-T细胞扩增活化，进而能有更多的CAR-T细胞浸润到实体瘤组织中，夺取抗癌斗争的胜利呢？ 这就是马乐园设计CAR-T细胞专属疫苗的基本思路。 恰好，Irvine实验室在2014年曾开发出一种将免疫分子佐剂特异性输送到淋巴结组织的方法。[1] 马乐园想到，如果在Irvine团队所开发出的分子佐剂中加入肿瘤抗原的成分，不就可以把更多的CAR-T细胞激活送往前线抗击肿瘤了吗？ 结果证明，马乐园的这一想法是可行的。他设计出了一种连接了癌症抗原分子的分子佐剂，即CAR-T疫苗，而CAR-T细胞在CAR-T疫苗的刺激作用下活性显著升高，清剿实体瘤的表现也大幅增强。[2] 这一研究成果的论文，在第一轮同行评议的过程中，得到了《科学》杂志编辑和审稿人的一致好评。其中有审稿人好奇：外源注入的CAR-T细胞在清除肿瘤的战役中居功至伟，但内源的T细胞在此过程中发挥了多大的作用呢？ 当然，这一问题是否能回答上，都不影响投稿论文的发表进程。不过，马乐园决定从经过CAR-T细胞治疗的小鼠体内的肿瘤组织中分离出内源T细胞，对其活性进行测定，以回应审稿人的疑问。 肿瘤组织附近营养物质缺乏，再加上癌细胞会分泌免疫抑制分子，研究者们普遍认为在如此恶劣的环境下，内源的免疫细胞大部分都已油尽灯枯，免疫活性极低。 因此在做补充实验时，马乐园对于内源T细胞在抗击实体瘤过程中的“战斗力”并没有抱太多期望。 但是，眼前的结果令他为之一震。
2 如果把肿瘤组织中的癌细胞想象成一支破坏身体健康的“叛军”，这支叛军实际上包含了诸多“军团”。不同的癌细胞表面表达着不同的“抗原”分子，就如同不同集团军拥有不同的“番号”一样。 在设计CAR-T细胞时，研究者往往是针对癌细胞叛军中最精锐部队的“番号”对CAR-T细胞进行“体外培训”，从而使得CAR-T细胞在被输入体内后能通过抗原识别第一时间找到叛军中的精锐部队展开战斗，实现对于肿瘤组织最大程度的杀伤。 这一当前最为通用的作战策略却也导致了CAR-T细胞疗法的一大局限：由于CAR-T细胞只能有效识别、杀伤癌细胞中的精锐，因此总会有一部分癌细胞会躲过CAR-T细胞的追杀，等待治疗结束之后便又会死灰复燃。CAR-T细胞疗法的这一局限被称作“肿瘤逃逸”（tumor escape）。 而马乐园的补充实验结果却表明：在只有CAR-T疫苗或者CAR-T细胞刺激的情况下，内源识别肿瘤的T细胞数目和活性都不佳；但如果两者同时施加，原先偃旗息鼓的内源T细胞竟然被大幅扩增激活！ 这不禁令马乐园浮想联翩：在CAR-T疫苗和CAR-T细胞双重刺激下扩增和激活的内源T细胞，有没有可能在CAR-T细胞死磕掉癌细胞精锐部队的情况下，对“杂牌军”乘胜追击，完成“打扫战场”的任务呢？ 换句话说，原本偃旗息鼓的内源T细胞能否被CAR-T疫苗和CAR-T细胞重新动员起来，消灭掉癌细胞的残军败将？ 就像是《西游记》中的一个常见场景：孙悟空收服领头的大妖怪之后，猪八戒和沙和尚去把妖怪们的老巢一窝端掉。 哪怕是将视野从CAR-T治疗扩展到整个肿瘤免疫领域，动员内源免疫细胞的活性，对于癌症的有效控制都是至关重要的。 早在十几年前，就有研究者发现在接受同样治疗手段的癌症患者中，有一些“幸运”患者的内源免疫细胞得到激活，进而拥有更好的预后效果。对于这种外源输入的治疗在针对癌细胞的精锐部队进行输出后，内源免疫细胞发生扩增和活性，进而利用内源免疫细胞更广泛的抗原识别性质对战场上的残余癌细胞进行清剿。研究者将这种现象称作“抗原扩散”（Antigen Spreading）[3]。 但在这些“幸运患者”体内抗原扩散效应是怎么产生的，又该怎样改善癌症治疗手段才能让更多的患者成为产生抗原扩散反应的“幸运儿”呢？ 遗憾的是，这些在整个癌症研究领域的重要问题，人们的了解还很有限。 马乐园在看到那个神奇的补充实验结果的一刹那，就意识到这一发现很可能为回答以上问题提供了一个全新的突破口： 如果把CAR-T细胞当作神通广大的齐天大圣，那么他所设计出的CAR-T疫苗就好似从观音菩萨那里借来的“法宝”——这一法宝不仅能直接提升大师兄的战斗力，竟然还能同时对于二师弟、三师弟的表现有激励作用。 问题来了，马乐园设计出的疫苗具体是如何影响CAR-T细胞的活性？又是如何激活并扩增内源抗肿瘤T细胞呢？ 凭借自己博士期间在癌症生物学打下的根基，马乐园自信摸清楚这背后的机制只是时间问题。 简单估算了一下背后所需的工作量，马乐园发现竟然需要准备至少200多只小鼠！ 因此他原本打算在独立之后组建团队，再对这些问题进行探索。 意外降临的新冠疫情，打乱了他的计划。 3 当意识到2020年度的学术界招聘市场将受到疫情的严重打击后，马乐园决定沉下心来，以博后的身份在麻省理工学院继续探索CAR-T疫苗的分子机制。 2020年的夏天，他快速完成了三个实验，证实CAR-T疫苗结合CAR-T细胞确实能引起“抗原扩散”效应的事实。 首先，他验证了所采用的分析方法确实能精准检测出内源T细胞的激活。已知干扰素γ的分泌对于内源T细胞的激活非常必要，那么向小鼠体内输入干扰素γ抗体，那么其与干扰素γ结合，内源T细胞没有被激活的情况下如果依然能检测到信号，就说明之前的发现只是“假阳性”。实验的结果让他长舒了一口气：在输入干扰素γ抗体之后，激活信号完全消失了，也就是说他的检测方法能灵敏检测出内源T细胞的激活。 但是，这些诱导内源T细胞扩增并激活的干扰素γ从哪里来呢？ 对此，马乐园做了第二个关键实验：他利用缺失干扰素γ的基因的小鼠的T细胞制备CAR-T细胞，发现此时的CAR-T细胞不再能与CAR-T疫苗一起激活内源T细胞，表明在疫苗刺激下CAR-T细胞所分泌的干扰素γ对于诱导并活化内源抗肿瘤T细胞的必要性。 第三，马乐园最初是在一种小鼠脑瘤模型中发现的“抗原扩散”效应。他接下来又在另一种小鼠的黑色素瘤模型中发现存在类似的表型，说明CAR-T疫苗联合CAR-T细胞对于内源抗肿瘤T细胞的激活效果具有推广到不同癌症类型的潜力。 到了2020年8月底，马乐园大致梳理出了一个模型：CAR-T疫苗首先刺激CAR-T细胞分泌出了大量干扰素γ，进而促进免疫系统诱导内源抗肿瘤T细胞引发“抗原扩散”效应。 由此依据干扰素γ的上下游，自然延伸出了两个研究方向：第一，CAR-T疫苗如何诱导CAR-T细胞分泌干扰素γ？第二，CAR-T细胞分泌出的干扰素γ影响了如何引起“抗原扩散”效应？ 为了探索干扰素γ分泌的上游机制，他从小鼠的肿瘤组织中分选出CAR-T细胞，利用RNA测序技术对其转录组进行分析。 马乐园发现，在CAR-T疫苗刺激下，CAR-T细胞中多种代谢通路，尤其是线粒体功能相关的众多基因表达量显著上调。由此他推测T细胞疫苗刺激改变了CAR-T细胞的代谢活性。 几乎在同一时间，英国剑桥大学Gillian Griffiths教授的团队报道线粒体活性的上调是引起杀伤性T细胞分泌更多干扰素γ的主要原因，印证了马乐园的猜想。 在探索体内免疫机制过程中，小鼠遗传学工具是一大利器，能帮助研究者在不同的因素之间建立起强有力的因果联系。比如马乐园猜测X细胞的Y基因在介导CAR-T细胞和T细胞疫苗引起“抗原扩散”效应的过程中发挥了重要作用，那么他就可以在将要接受肿瘤移植的小鼠体内选择性地移除X细胞，如果X细胞移除后“抗原扩散”效应消失了，就说明X细胞发挥了关键作用；而如果能进一步在X细胞中选择性地把Y基因敲除，发现即使X细胞尚在，可一旦少了Y基因就无法引起“抗原扩散”效应，则可以将目标进一步缩小，证明X细胞所表达的Y基因对于“抗原扩散”效应的激发来说是必要的。 因此，马乐园选择继续用小鼠模型来研究干扰素γ如何影响内源抗肿瘤T细胞扩增并激活这一下游机制。 当时间来到了2021年12月，马乐园大致勾勒出了CAR-T细胞和T细胞疫苗共同诱导产生抗原扩散效应的机制原理：CAR-T疫苗在激活CAR-T细胞后，CAR-T细胞所分泌的细胞因子干扰素γ激活了肿瘤组织内的“树突状细胞”，后者被激活后一方面分泌细胞因子IL-12维持CAR-T细胞的激活状态，同时又充当了“信使”角色，携带着癌细胞的抗原到淋巴结中去“报信”。淋巴结中的内源T细胞收到来自树突状细胞的信号后被激活，经过扩增活化后离开“大本营”来到肿瘤组织加入战场，与CAR-T细胞并肩作战，对于CAR-T细胞所不能识别的那部分癌细胞进行清剿。 基于这一机制，马乐园在不引起过强毒副作用的情况下进一步增加CAR-T细胞的干扰素γ分泌量，发现确实能进一步提升“CAR-T细胞+CAR-T疫苗”疗法的抗癌效果。

马乐园从补充实验出发，做出了新的发现。受访者供图。
4 2022年1月，马乐园在美国宾夕法尼亚大学建立自己的实验室，同时开始着手对这一系列实验进行整理和写作。 2022年10月，论文初稿完成，他将其投到《细胞》，同时发表于公开的预印本网站BioRxiv上。[4] 意外的是，在杂志的审稿意见返回之前，西奈山医学院的同行Jaime Mateus-Tique和Brian Brown就关注到了这篇预印本论文，并在《自然-免疫学综述》发表评论，称“这项工作为今后增强CAR-T细胞疗法并克服与抗原异质性或丧失相关的肿瘤耐药机制的挑战奠定了基础”。[5 ] 2022年12月，审稿意见返回，四个审稿人中只有一位对于这项工作的创新性提出了疑问。在接下来的几个月时间里，马乐园几次飞回波士顿，与Darrell Irvine实验室的Alexander Hostetler和Laura Maiorino以及自己实验室的研究生Alexandra Neeser一起完成补充实验，以回答审稿人的问题。 2023年5月，这一论文被《细胞》正式接收，并在7月6日正式上线[6]。

马乐园博士揭示的CAR T疫苗激活抗原扩散效应的机制图。图源：参考文献[6] 凭借在CAR-T细胞疫苗领域作出的科学贡献，马乐园在2022年被美国国立卫生研究院授予“新兴创新奖”（NIAID New Innovators Award）。 读博期间，马乐园在麻省大学医学院Michael Green教授 （ Michael Green教授不幸在2023年2月10日因病去世）的指导下，花了七年的时间完成了通过全基因组RNA干扰筛选、单细胞测序 和CRISPR-Cas9介导的饱和性突变筛选研究癌症耐药机制的三个独立课题。虽然博士毕业后，马乐园已在分子生物学和肿瘤遗传学领域非常熟悉，但选择加入Irvine实验室时，可以说在生物工程设计和免疫学方面毫无基础。虽然如此，马乐园从零开始边学边做，最终不仅精通这两个全新领域并以难以置信的速度取得以上突破性成果。现在，掌握了多领域理论和技术的他，得以自由横跨多个领域。其在宾大的独立实验室也步入正轨，继续新型T细胞疗法和免疫工程技术的探索。 一方面，他通过与宾大细胞治疗中心的医生科学家合作，将新型T细胞疫苗推向应用于癌症患者的临床试验。另一方面，积累了充足科研经费的马乐园，也已经确定了下一个科学攀登的目标——开发能够应用于不同类型癌症治疗的广谱性新型CAR-T细胞。

踏足学科交叉的未知领域，机会总是与风险并存。但有勇气和毅力，以及对探索未知的热情和动力，就有可能做出新的发现——这是马乐园对科学的理解。

注：马乐园团队正在招聘博后研究员，有意者请联系：[email protected] 和 [email protected] （请同时抄送两个邮箱） 参考文献: 1. Liu, H. et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature 507, 519-522, doi:10.1038/nature12978 (2014). 2. Ma, L. et al. Enhanced CAR-T cell activity against solid tumors by vaccine boosting through the chimeric receptor. Science 365, 162-168, doi:10.1126/science.aav8692 (2019). 3. Butterfield, L. H. et al. Determinant spreading associated with clinical response in dendritic cell-based immunotherapy for malignant melanoma. Clin Cancer Res 9, 998-1008 (2003). 4. Ma, L. et al. Eradication of tumors with pre-existing antigenic heterogeneity by vaccine-mediated co-engagement of CAR T and endogenous T-cells. bioRxiv , 2022.2010.2005.511036, doi:10.1101/2022.10.05.511036 (2022). 5. Mateus-Tique, J. & Brown, B. Tumour antigen spreading mediated by vaccine-boosted CAR T cells. Nat Rev Immunol 23, 7, doi:10.1038/s41577-022-00811-3 (2023). 6. L.Y. Ma et al ., Vaccine-boosted CAR T crosstalk with host immunity to reject tumors with antigen heterogeneity. Cell (2023). DOI: 10.1016/j.cell.2023.06.002
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