《中国海洋鱼类耳石信息分析》

新书预热，公开一下导论，以便了解本书内容。

顺便再自吹自擂几句：本书系统描述了800余种中国海洋鱼类的耳石形态，是目前大陆唯一系统的耳石图鉴；系统介绍了耳石鉴定年龄日龄的技术流程，并附有二维码，可扫码观看实验过程，直观了解技术细节

导论

耳石（otolith）位于硬骨鱼后脑两侧的内耳膜迷路系统(membrane labyrinth system)中，是硬骨鱼类特有的高度钙化的硬组织。其英文词意源自希腊语和拉丁语，由两部分组成——oto（ear，耳石）和lith（stone，石头）。顾名思义，即鱼类内耳中的石头，由此中文得名“耳石”。耳石是由生物矿化作用（bio-mineralization）所形成的碳酸钙结晶，是鱼类听觉和运动、平衡的感觉器。耳石底部与内耳纤毛细胞相接触，外来的声波震动以及重力方向的改变，借由耳石的质量与惯性移动，牵动附于其上的纤毛神经细胞，产生动作电位信号传递至脑部，从而构成鱼类的平衡和听觉系统。

内耳膜迷路系统分为上下两部分，上半部由前半规管、水平半规管和后半规管等三个半规管以及椭圆囊(utricular vestibule)组成；下半部由球状囊(saccular vestibule)和听壶(lagenar vestibule)组成。椭圆囊、球状囊及听壶中各有一对耳石，分别为微耳石(lapillus)、矢耳石(sagitta)和星耳石(asteriscus)。多数硬骨鱼类的矢耳石体积最大；而骨鳔鱼类，则因韦伯氏器与鱼鳔相连，替代了部分耳石的功能，矢耳石相对退化。

鱼类前庭器构造及耳石位置A：典型真骨鱼类头盖骨掀开后前庭背面观，B：典型真骨鱼类与骨鳔鱼类

骨鳔鱼类（图示为鲫鱼Carassius auratus）三对耳石位置及相连的韦伯氏器、鳔

耳石的主要成分为碳酸钙结晶，碳酸钙的结晶型有三种类型：方解石(calcite)、霰石(aragonite)、球霰石(vaterite)。在三对耳石中，矢耳石和微耳石的主要碳酸钙晶型以霰石和方解石为主，星耳石则以球霰石为主。

在一些异常因素的作用下（目前有各种假说，但暂未有定论），矢耳石和微耳石的霰石、方解石结晶部分或全部转为球霰石，外观呈现为部分或全部耳石透明化，此一异常现象被称之为晶化（crystalization）。

大麻哈鱼Oncorhynchus keta耳石对比，左为正常耳石，右为晶化的耳石

由霰石构成的耳石一般呈乳白色，质地较硬；而球霰石构成的耳石透明度高，质地较脆，肉眼即可发现二者差别。耳石的碳酸钙沉积贯穿鱼类生长、发育、繁殖直至死亡的全过程，晶化可能发生在上述的任何阶段之中，即鱼类一生的任何阶段都可能出现耳石晶化现象。晶化部分的耳石因为晶体结构改变，无法正常沉积蛋白质及微量元素，同时形态也发生明显改变，因此无法应用于研究之中。

大口黑鲈Micropterus salmoides晶化耳石，未晶化的核心部分可见清晰日轮，晶化部分则缺失

耳石的摘取和保存

摘取耳石的鱼类样本，以鲜活个体为最佳，如需长期保存，尽量采用冷冻方式保存（裹水冻保存时间更长），次要选择为酒精保存（长期浸泡于酒精中的个体，耳石较难清理），切不可选择甲醛（甲醛的微酸性会腐蚀耳石，无法进行后续分析）。对于仔稚鱼样本，因个体较小，冷冻后再解冻不易保持完整，推荐用酒精保存。

耳石的摘取需根据鱼的种类、大小、发育程度及耳石本身的性质来选择合适的方法，常用的方法有横切法、开颅法、对开法和过鳃法等。研究人员需积累一定的经验，才能在保证耳石完整的前提下快速又准确地将其取出。

开颅法

沿水平方向将颅骨上部切除，以镊子将大脑组织摘除后，即可看到包含半规管在内的内耳。三对耳石清晰可见，此时可用镊子取出耳石。在需要摘取三对耳石时，此方法较为合适。

开颅法摘取耳石（黑色箭头所示）流程示意（a→b→c→d→e）

横切法

从头部后方沿横切面将整个头部切断，向前观察，可见到颅腔上部的大脑后部，以及位于侧方和下方的内耳腔室，耳石可直接用镊子取出。在熟悉鱼体结构后，此方法效率较高。

横切法摘取耳石（黑色箭头所示）流程示意（a→b→c）

对开法

纵向沿头部中线将其切分为左右两半。因为内耳的侧方中心位置也位于此区域，所以此部分必须精确地切开。分别处理分开后的左右侧头骨，移除大脑后即可摘取耳石。对于不熟悉的物种而言，这也是较为有用的办法。

对开法摘取耳石（黑色箭头所示）流程示意（a→b→c→d）

过鳃法

从腹面摘除整个鳃组织后或从侧面鳃弓基部破开颅骨，即可清晰观察到内耳构造并摘取矢耳石。当需要最大程度保留摘取耳石后的头部时，这种方法尤为合适。

过鳃法摘取耳石（黑色箭头所示）示意

仔稚鱼耳石摘取

因体形较小，一般需在体式显微镜下操作，以镊子或解剖针挑取耳石。因鱼身相对透明，时常可透过皮肤和肌肉直接观察到耳石，以解剖针移除头骨及脑组织后，即可取出。此时期耳石较小，容易与骨骼、肌肉等组织碎片混杂，也易埋没于脑脊液之中，可加装偏光镜或暗场镜，增加耳石与其余组织的对比度。

仔鱼耳石摘取示意，a偏光显微镜下的智利串光鱼Vinciguguerria nimbaria，s为矢耳石，l为微耳石，b以解剖针移除脑组织后取出的耳石，黄色箭头为矢耳石，红色箭头为微耳石

摘取出的耳石，需及时清洗，去除附着的组织和脑脊液等以便长期保存，有条件的可使用低浓度碱液浸泡或超声波清洗机震荡，以彻底去除有机物，之后自然风干或置于恒温烘箱40℃干燥24小时后保存于离心管或密封袋中，并加以编号以便后期管理、分析。较薄的耳石，也可保存于70%的酒精之中，以防耳石脱水干裂。如无法及时清洗，也可将摘取出的耳石保存于70%酒精中，后续再进一步处理。如预期进行元素成分等微化学、同位素分析，耳石摘取、清洗过程需避免外来元素污染，摘取工具应避免使用金属及玻璃材质，而以竹木、橡胶或塑料材质为宜，清洗时也需使用去离子水或超纯水。

耳石结构

系统研究之前，须先统一耳石的立体结构及各部位名称，以便研究者交流、沟通。耳石的方位及朝向命名延续了通用的解剖学方位术语，位于鱼体左侧的称为左耳石，右侧则为右耳石。朝向鱼体正中切面的为内侧面（internal，proximal或medial），听沟即位于内侧面，朝向外侧的则为外侧面（external，distal或lateral）。

进一步可分出三个互相垂直的切面，也是耳石年龄/日龄分析时常选取的三个方向：矢状面（亦称纵切面，sagittal section），由头至尾部的垂直切面；横切面（transeverse section），沿背腹轴，垂直于耳石中线的切面；水平面（frontal section），沿头部至尾部的水平切面，方向与矢状面垂直。此三个方向的沉积速度不同，早期矢状面和水平面较快，使得耳石呈现内外侧扁的椭圆形，随鱼体年龄增长，矢状面和水平面增长逐渐减缓甚至停止，而横切面曾始终保持沉积，即耳石厚度不断增加。

耳石切面示意图

朝鱼头方向的耳石部位称为前缘（anterior），反之朝向鱼尾的则为后缘（posterior）。朝向鱼背方向的称为背缘（dorsal），亦可细分为前背缘（anterodorsal）、后背缘（posterodorsal），与之对应的则为腹缘（ventral），同样可细分为前腹缘（anteroventral）与后腹缘（posteroventral）。耳石内侧与听神经接触区（neuron insertion area）呈凹陷状，即听沟（sulcus acusticus）。。

耳石结构示意图（图示为右耳石）

耳石各部位可再分为：

主间沟Excisura (or excisura major): 听沟在耳石前端开口形成的沟槽，如听沟不伸达前端，则缺失。

主缺刻Notch: 主间沟凹入形成的缺刻，为基叶和翼叶的分界区域。

基叶Rostrum: 主缺刻下方，耳石前部的延展区域。无延展或主间沟缺失时，则无。

翼叶Antirostrum: 位于主缺刻上方，耳石背缘向前的扩展延伸区域。无延展或主间沟缺失时，则无。

颈部Neck: 听沟前部与后部的交界区，常表现为听沟宽度的收束。

听沟前部Ostium:以颈部为分界线，听沟位于耳石前部的部分。

听沟后部Cauda: 以颈部为分界线，听沟位于耳石后部的部分。

听沟丘Colliculum: 听沟内的隆起区域，以颈部为界，可分为前后两个区域。

听沟下嵴Crista inferior: 听沟腹缘的嵴。

听沟上嵴Crista superior: 听沟背缘的嵴。

背缘凹陷Dorsal depression: 位于听沟上方，耳石背部的凹陷区，形态多变。

背缘后角Postero-dorsal angle: 耳石背缘后部的转折处。

鱼类耳石形态具有高度的种特异性，即不同种类的鱼类耳石形态不同，可借此区分、鉴定物种，尤其在鱼体外部形态缺失的情况下，是鉴定种类的重要依据，如胃含物分析、遗址出土鱼类残骸、化石鱼类等。但也因鱼类耳石形态的高度多样性，目前对其外形缺乏相对统一的标准进行描述，下图仅做展示。

鱼类耳石形态的多样性

与外形的多样性相似，听沟的形态类型也是分类的重要依据，尤其在科、属级别的区分之中，听沟可依据位置及开口情况分为以下类型：

封闭型（mesial）：听沟封闭，不在任何位置开口。

前端开口型（ostial）：听沟前部在耳石前端或背缘开口，后部封闭。

前端近开口型（Pseudo-ostial）：听沟前部边缘极为接近耳石前缘或背缘，但不开口，后部封闭。

前端微开口型（Para-ostial）：听沟在耳石前缘或背缘开一窄口，后端封闭。

前后开口型（Ostio-caudal）：听沟在耳石前后部均开口。

前端开口、后端近开口型（Ostio-pseudocaudal）：听沟在耳石前缘或背缘开口，后部边缘极为接近后缘或腹缘，但不开口。

后端开口型（caudal）：听沟在耳石后缘或腹缘开口，前部封闭。

前后近开口型（Pseudo-ostiocaudal）：听沟边缘极为接近耳石前、后缘，但不开口。

耳石听沟类型示意图

耳石的时间信息

年龄和生长的研究历史悠久，鱼体身上的多种硬组织结构都记录着个体的时间信息。耳石被应用于年龄鉴定的时间晚于脊椎骨与鳞片，直到1899才由Reibisch首次用于鉴定比目鱼Pleuronecteus plastessa的年龄。1971年，美国耶鲁大学地质学家Gregor Pannella首次发现银无须鳕Merluccius bilinearis等数种鱼类耳石上存在日轮，将鱼类定龄的精度由年改写为天，从此改变了鱼类年龄研究的历史。耳石在鱼体中形成时间最早、终生存在，也不因脱落和再吸收等问题丢失时间信息，是时间记录最完整且精度最高的硬组织（唯一记录有日龄信息），因此逐渐成为分析的主流材料。

鱼类栖息于水域环境之中，新陈代谢活动贯穿于其生长、发育、繁殖直到死亡的过程。水域环境的周期变化（日，季度，年等），作用于鱼类个体使得其生理同步变化，这种周期变化记录在耳石上，形成了有规律的同心环纹，这些同心的相似环纹以紧密或稀疏的痕迹表现出来，这就是生长的表征。

生活在温带地区的物种，春夏季节水温上升、饵料生物繁盛，生物体代谢旺盛、摄食强度大、生长迅速且均衡，此时形成的环纹宽且稀疏；到秋冬季节，水温下降、饵料生物贫乏，生物体代谢缓慢、摄食强度小，生长缓慢甚至停止，此时形成的环纹狭且致密。到翌年春季则恢复生长，开始新一轮周期。如此在硬质组织上表现为明亮（蛋白质含量低）和昏暗环纹（蛋白质含量高）交替排列的现象，一年之中形成的明带和暗带合称为年增量（annual increment），明暗带间明显的分界线称为年轮（annuli）。对生活在热带地区的物种，因水温相对稳定，取而代之的是低盐度的雨季和高盐度的旱季交替。

阴历月、昼夜以及潮汐节律的交替，以及相应的生物体行为、饵料保障等周期变化，同样表现为明暗相间的环纹。以昼夜为周期，一天之中形成的明暗带即合称为日增量（daily increment），明暗带间的分界线称为日轮（daily ring）。

值得注意的是，年轮（日轮）的形成不单纯是水温、饵料条件等直接作用的结果。年轮形成的时间不是固定的，也不是所有个体同时形成，而是随年龄、群体而有所差异。性未成熟鱼年轮形成一般较性成熟个体早，如小黄鱼，一龄鱼耳石年轮较高龄个体早两个月形成。个体生活史中的某些阶段（孵化，开口摄食，变态，沉降等），因生活环境与自身代谢的剧烈变化，也会形成与周边轮纹显著不同的标记轮（check ring）。外界因素的随机刺激，如飓风、赤潮、捕食者袭击等，也可能引起生长、代谢的异常，从而在硬组织上留下记录。综上，年轮的形成不单是营养、水温周期变化引起的新陈代谢、生长速度调节所致，而是生物体在生长的过程中，内在遗传特性、生理机能与外界环境共同作用、协调统一，机体重新建立适应性代谢，开始新的生理周期的结果。

耳石的显微结构

耳石的原始生长点称为原基（primordium），多数鱼类仅具一个原基（多呈圆点状，也有其他形状），少数种类则具备多个原基。耳石的沉积均围绕原基进行，以原基为中心的区域为核心（core，nucleus）。鉴定年龄/日龄时的耳石或切片需包含耳石原基/核心在内，以获得完整的年龄信息。

眼斑雪冰鱼Chionodraco rastrospinosus稚鱼耳石，核心处可见多个原基

通常鱼体孵化时即在耳石上形成第一轮日轮，称为孵化轮（hatch check），卵黄消耗完转为外源性营养（即第一次开口摄食）时也会形成一标志轮，称为摄食轮或开口轮（feeding check）。部分变态发育鱼种（如鳗鲡目），耳石上留有的变态发育时期标志轮，部分海淡水洄游种类，在溯河进入淡水或降河进入海水生活时，也有显著的标志轮存在。

非洲鳗鲡Anguilla mossambica玻璃鳗幼体耳石显微电镜图，HC：孵化轮，FFD：开口轮，L：柳叶鳗期，M：变态期起始，FW：淡水生活期，比例尺为20μm

此过程中，钙质也可能不再围绕原基沉积，而是形成新的沉积中心，即次生原基（accessory primordium）（次生生长中心，accessory growth center/secondary growth center），其在鳕形目中很常见，一般认为是生活史转变时期的标志（如沉降等）。偶尔也会因各种异常因素，在耳石上形成次生原基。

阿根廷无须鳕Merluccius hubbsi（全长43mm）耳石示意图，N：耳石原基，AGC：次生原基，比例尺100μm 

秋刀鱼Cololabis saira耳石上因异常因素形成的次生原基

年龄/日龄鉴定

薄且透明的耳石，摘取、清洗后即可直接观察年轮/日轮，也可选择将耳石浸入酒精、甘油或二甲苯中进一步增强透光性，使得年轮/日轮易于观察。

随鱼体生长，耳石钙质组织也不断沉积，表现为长度、宽度和厚度三维的生长，其中厚度在鱼体一生中持续增长，使得耳石透光性下降以及边缘的轮纹难以观察。此类高龄个体以及具有大而不透明耳石的鱼种，需对耳石进行切割或研磨后（以物理方法使厚度减少，增加透光率）才能观察到清晰的年轮。因耳石较小且脆，需以一定的材料加以包埋，以方便操作，常用的包埋材料见下表：

随鱼种、个体大小不同，切片、研磨选择的方向也有所不同，切片的厚度也随鱼种有所不同（通常为0.3~1.0mm）。南方魠Kyphosus bigibbus提供了一个很好的示例，当在合适的厚度及研磨状况下，光线穿过年轮的夹角达到最优，此时年轮最为清晰。在实际鉴定中，需多加尝试以找到不同鱼种的最优厚度，本书后文将稍加介绍，以笔者之经验，一般耳石越厚，则最优厚度越厚。

不同厚度下透射光穿过年轮的夹角及年龄清晰度示意，a南方魠Kyphosus bigibbus耳石示意图，b切割轴示意及不同厚度，c1-2mm厚度时年龄清晰度及透射光夹角，d 100-200μm厚度时年龄清晰度及透射光夹角，e 100-200μm厚度高龄个体年轮示意图

光源的选择

具体的年轮标志随鱼种以及观察时所用的光源（透射光，折射光）而有所不同。 反射光下，年轮带因较高的蛋白质含量，可吸收反射更多的光线，因此年轮呈白色；透射光下，年轮带较高的蛋白质含量则阻挡了更多光线穿透耳石，年轮呈暗色。这种化学成分的差异不仅在光学表现上，其它年轮/日龄分析时采用的化学、光学处理（如烧蚀，酸洗等）均基于此。

反射光（左）与透射光（右）下的南极电灯鱼Electrona antarctica年轮不同的光学表现（白色三角标示年轮）

烧蚀法即蛋白质烧蚀反应，以烘箱烘烤（280℃）或酒精灯直接灼烧耳石，使得暗带略微呈棕色，增强与明带的对比。有条件的，可进一步选用紫外光作为光源，即利用蛋白质荧光反应，暗带在紫外光下会更容易观察。

【南极特辑】【耳石特辑】罗斯海鼠尾鳕年龄

酸洗则是利用明暗带对酸液腐蚀的耐受度不同，将耳石浸入低浓度的酸液中一小段时间，利用酸液腐蚀增加明暗带的对比度（形成凹凸不平的平面）。酸洗是扫描电子显微镜分析日龄的必经操作，也常用于常规的年龄/日龄鉴定中。

EDTA酸洗30s后扫描电子显微镜拍摄的秋刀鱼Cololabis saira耳石日轮

干扰项

外界因素的随机刺激，如飓风、赤潮、捕食者袭击等，也可能引起生长、代谢的异常，从而在硬组织上留下记录，造成年龄信息的缺失，或者形成不规律的环纹（副轮，false ring），造成年龄信息的误判。年轮生长连续，在耳石各个方向形成一圈，而副轮生长不连续，轮间距不规则，或轮纹宽度较窄。在研究过程中，可以此区分，减小副轮造成的鉴定误差。

小黄鱼Larimichthys polyactis耳石副轮示意图（白色三角标示）

与年龄鉴定中的副轮类似，日龄鉴定时也存在干扰项。常见的有以下三种类型，即次日轮，镜像或阴影。在观察鉴定日龄时，可多加调节显微镜焦距，以排除此类干扰项，也需累积经验加以分辨。

常见日龄干扰项示意图，从左至右依次为次日轮、镜像及阴影

参考文献：

1.Morales-Nin, B. and J. Panfili, Manual of Fish Schlerochronology. 2002.

2.Bridget, S., et al., TROPICAL FISH OTOLITHS: INFORMATION FOR ASSESSMENT, MANAGEMENT AND ECOLOGY (REVIEWS: METHODS AND TEC.Apress, 2002: p. 211-233.

3.Lin, C.H. and C.W. Chang, Otolith Atlas of Taiwan Fishes. 2012: Otolith Atlas of Taiwan Fishes.

4.Réveillac, E., et al., Clues to the location of the spawning area and larval migration characteristics of Anguilla mossambica as inferred from otolith microstructural analyses. Journal of Fish Biology, 2010. 74(9): p. 1866-1877.

5.Buratti, C.C. and B.A. Santos, Otolith microstructure and pelagic larval duration in two stocks of the Argentine hake, Merluccius hubbsi. Fisheries Research, 2010. 106(1): p. 2-7.

6.Yoshimi Ogino, et al., Using optimised otolith sectioning to determine the age, growth and age at sexual maturity of the herbivorous fish Kyphosus bigibbus: with a comparison to using scales.Marine and Freshwater Research, 2019.

7.Johnson, W.G.a.R., Imaging of otoliths for analysis of fish age and growth: a guide for measuring daily increments in adult and juvenile otoliths using Image-Pro Premier ®, University of California Davis, Center for Watershed Sciences. 2016.